三种腺苷酸分离鉴定:醋酸纤维素薄膜电泳法

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所属分类:蛋白质组学

一、原理

带电粒子在电场中向着与其自身带相反电荷的电极移动的现象,称为电泳。控制电泳条件(如pH 等),使混合试样中的不同组分带有不同的净电荷,各组分在电场中移动的速度或方向各不相同,从而达到分离各组分的目的,这就是电泳分析法。以醋酸纤维素薄膜作支持物进行电泳分析的方法称为醋酸纤维薄膜电泳法。

在pH4.8 电泳缓冲液条件下,带有不同量磷酸基团的AMP、ADP、ATP 解离之后,带有负电荷量的顺序为:ATP>ADP>AMP,它们在电场中移动速度不同,从而得到分离。

又利用核苷酸类物质的碱基具有紫外吸收性质,将分离后的电泳醋酸薄膜放在紫外灯下,可见暗红色斑点,参照标准样品在同样条件下的电泳情况,对混合试样分离后的各组分进行鉴定。

二、仪器与试剂

1. 仪器

(1)电泳仪、电泳槽(平板式)

(2)紫外灯

(3)电吹风、医用镊子

(4)醋酸纤维素薄膜(8 cm×12cm)

(5)微量进样器(10 μl 或50 μl)

2. 试剂

(1)柠檬酸缓冲液(pH4.8):称取柠檬酸8.4 g,柠檬酸钠17.6 g,溶于蒸馏水,稀释到2000 ml。

(2)标准腺苷酸溶液:用蒸馏水将纯AMP、ADP、ATP 分别配成100 mg/10 ml 溶液。其中AMP 需略加热助溶。置冰箱备用。

(3)混合腺苷酸溶液:分别取上述标准液AMP、ADP、ATP 各1 份等量混匀。置冰箱备用。

三、操作步骤

1. 点样:将醋酸纤维素薄膜放入pH4.8 柠檬酸缓冲液中,待膜完全浸透(约0.5 h)后用镊子取出,夹在清洁的滤纸中间,轻轻吸去多余的缓冲液,仔细辨认薄膜无光泽面,用微量进样器在无光泽面上点样。点样点距薄膜一端1.5 cm,样点之间距离1.5 cm。点样量为2~3 μl,按少量多次原则分2~3次点完。

2. 电泳:向两个电泳槽内注入pH4.8 的柠檬酸缓冲液,缓冲液的高度约为电泳槽深度的3/4。(注意:两槽中电泳液面一致)。用宽度与薄膜相同的滤纸作“滤纸桥”连接醋酸纤维素薄膜和两极缓冲液。待滤纸全部被缓冲液浸湿后,将已点样薄膜的无光泽面向下贴在电泳槽支架的“滤纸桥”上。

点样端置于负极方向,盖上电泳槽盖,接通电源,在电压降为10 V/cm 的条件下进行电泳,一小时后关闭电源,取出醋酸纤维素薄膜,用电吹风吹干。

3. 鉴定:用镊子小心地将吹干的薄膜放在紫外灯下观察,用铅笔划出各腺苷酸电泳斑点,并标明各斑点的腺苷酸代号。

绘出三种标准核苷酸及样品的电泳图谱,以标准单核苷酸的迁移率作标准,鉴别试样中各组分。

四、附注

1. 电泳前,一定要检查电极正负极与薄膜方向,确定负极接在薄膜的点样一端,因为样品是带负电荷,接通电源后,样品要在薄膜上向正极泳动;确定薄膜的无光泽面朝下。

2. 点样时,要控制点样点的大小在直径为2~3 mm,样点不可太大,否则电泳后观察结果不理想。

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