醋酸纤维膜电泳操作方法

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醋酸纤维膜电泳是一项简便而又迅速的方法。它的优点是:①电泳区带分离清楚,比琼脂 平板电泳分辨率高;②可以定量;③样品用量少,只需要几微升即可。

(一)材料与试剂

1.pH8.6离子强度0.05巴比妥缓冲液

2.0.5%氨基黑染色液

3.透明液:冰醋酸 3 份 ;95%乙醇 2 份 混合即可

4.醋酸纤维

(二)操作方法

1.将醋酸纤维膜条浸于巴比妥缓冲液中,浸透后用竹镊子夹到滤纸上,吸去过多的水分。将膜的光滑面向下搭在电泳槽 两侧的滤纸桥上,注意搭平。

2.加样 用微量加样器于负极端1.5cm处加样1µl~3µl,注意样品要成一条直线且垂直方向。也可用血球计数板盖玻片蘸取样品轻轻点上。

3.电泳 电压10V/cm~15V/cm或0.4mA/cm~0.6mA/cm电泳45min~60min,至电泳区带展开约2.5cm~3.5cm时,关闭电源。

4.染色 将膜浸于氨基黑染色液中,染色数分钟。

5.透明 将染色的醋酸纤维膜浸于透明液中,漂洗5min ~10min,至背景呈乳白色为止。为了防止膜上出现许多气泡,可以逐渐升高透明液浓度10%、20%以至30%。

6.结果观察及保存 透明后,将膜贴于玻璃上,干后取下,即可观察结果并保存。

7.定量 将各区带剪下,分别浸于4Mol/L NaOH 4ml中,振摇数次,约2h,色泽被浸出,于580nm~620nm比色,测出各区带的OD值。同时剪一块大小相似无蛋白的透明膜同样处理,做为对照。

计算各区带蛋白含量百分比(以血清为例)

总OD值T=A α1 α2 β γ

白蛋白%=A/T×100%

以此类推。

(三)注意事项

1.醋酸纤维膜孔隙小,含水量少,且较薄,因此它对热很敏感,故应注意控制电压、电流。

2.样品不可过多,只需几微升即可。

3.加样一定要呈直线、垂直、分布均匀,这样泳动的区带整齐、不歪。

4.注意醋酸纤维膜的质量,浸泡很久仍有大块白色硬点者可弃之不用。

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