琼脂糖电泳步骤之超级基础篇

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一、电泳前准备

准备内容

作用

1. 刷干净电泳制胶的梳子,板子,槽子,蒸馏水洗净晾干

防止不必要的重复污染,减少外来的污染。梳子干净有利于梳孔的形成。

2. 检查电泳槽,根据情况更换buffer

排除电泳槽的电极接触不良,确保buffer 的缓冲能力,减少污染。

3. 根据DNA 的分离范围选择合适的胶浓度并记录

达到较好的分离效果,防止样过快跑出胶或者是过慢浪费时间。

4. 计算agarose 的用量和制胶 buffer 的用量记录,胶最终越薄越好。

实验记录备查

二、制胶

步骤

注意事项

1. 称量agarosebuffer

Buffer 不要用成H2O ,称量相对准确

2. 融胶,加热到胶产生大量的气泡时,拿出摇匀,继续加热到完全溶解,拿出摇匀,再加热到沸腾。

非常热,小心烫手,另外注意不要加热过度使胶冲出瓶子。因此注意选择起码为胶体积2 倍以上的瓶子。保证胶混匀和完全溶解,减少可能因此引起的胶中孔径不均匀影响分离效果。

3. 倒胶,可用水浴的办法使胶冷却到60 度左右,即手可以握住瓶子的温度,沿着制胶板的一侧,缓缓地一次性倒入。梳子最好是预先放好并固定的,注意梳孔的体积能点的下所有的样。用枪头赶掉气泡。

制胶的桌面相对水平。倒胶时尽量减少气泡的产生。EB 如果在制胶时加入,在60 度左右时加入,使终浓度为0.5ug/ml 。不宜过低,染色成像不明显;不宜过高,导致背景太深。摇匀要沿着瓶壁摇动,尽量减少气泡产生的可能性。高浓度胶例如2% 以上的EB 很难摇匀,而且凝的速度也相对快,强烈建议跑完胶之后再用EB 染色。

4. 室温凝胶30 分钟

过程中不要碰到梳子,尽量保持胶的位置不移动。时间不宜过久,导致胶干燥变形;不宜过短,影响胶内部孔径形成。

5. 拔梳子,放入电泳槽。

缓缓地将梳子垂直从梳孔拔出,尽可能使梳子是同时从各个胶孔拔出的。暂时不用的胶最好放入电泳槽电泳液中浸泡。电泳液要浸没胶1mm

三、上样电泳

步骤

注意事项

1. 样品中加入loading buffer 使其终浓度为1 X ,混匀

Loading buffer 浓度不宜过低,点样时样品不能很好的沉在胶孔里;不宜过高,电泳时容易形成带形的变形。注意混匀。

2. 点样

沿着胶孔的边缘匀速加入。尽量避免碰坏胶孔。枪头不要吸过多的气泡,拔起时不要过猛带出样品。每点一个样完,吸取buffer 洗枪头,避免样品混杂。如果是有特殊要求,例如回收,强烈建议每点一个样换一次枪头。加样的速度当然是越快越好,注意保证质量。点样的量不要太大,一方面是体积不要太大,溢出污染邻位样品;一方面两不要太大,容易导致脱尾和模糊不清。

3. 接通电源,选择合适的电压和时间电泳。

胶孔与电极成水平状态,防止样品跑歪。跑胶期间不时回来看看,防止样品跑出胶等意外发生。

四、染色成像

步骤

注意事项

1. 染色

如果胶中没有加入EB ,用0.5ug/mlEB 溶液浸染30 分钟。

2. 调整镜头的拍摄范围和焦距,成像

 

3. 打印照片做分析记录

 

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