SDSPAGE凝胶电泳凝胶的制备方法

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SDS-PAGE电泳可用于分离蛋白质和核苷酸 ,这里综述了SDS-PAGE实验原理、试剂和器材、以及实验操作步骤。

一. 实验原理:

SDS-PAGE是对蛋白质进行量化,比较及特性鉴定的一种经济、快速、而且可重复的方法。该法是依据混合蛋白的分子 量不同来进行分离的。

SDS是一种去垢剂,可与蛋白质的疏水部分相结合,破坏其折叠结构,并使其广泛存在于一个广泛均一的溶液中。SDS蛋白质复合物的长度与其分子量成正比。在样品介质和凝胶中加入强还原剂和去污剂后,电荷因素可被忽略。蛋白亚基的迁移率取决于亚基分子量。

二. 试剂和器材:

试剂:1. 5x样品缓冲液(10ml):0.6ml 1mol/L的Tris-HCl(pH6.8),5ml 50%甘油,2ml 10%的SDS,0.5ml巯基乙醇,1ml 1%溴酚蓝,0.9ml蒸馏水。可在4℃保存数周,或在-20℃保存数月。

2. 凝胶贮液:在通风橱中,称取丙烯酰胺30g,甲叉双丙烯酰胺0.8g,加重蒸水溶解后,定容到100ml。过滤后置棕色瓶中,4℃保存,一般可放置1个月。

3. pH8.9分离胶缓冲液: Tris 36.3g ,加1mol/L HCl 48ml,加重蒸水80ml使其溶解,调pH8.9,定容至100ml, 4℃保存。

4. pH6.7浓缩胶缓冲液: Tris 5.98g ,加1mol/L HCl 48ml,加重蒸水80ml使其溶解,调pH6.7,定容至100ml, 4℃保存。

5. TEMED(四乙基乙二胺)原液

6.10%过硫酸铵(用重蒸水新鲜配制)

7. pH8.3 Tris-甘氨酸电极缓冲液:称取Tris 6.0g,甘氨酸28.8g,加蒸馏水约900ml,调pH8.3后,用蒸馏水定容至1000ml。置4℃保存,临用前稀释10倍。

8. 考马斯亮蓝G250染色液:称100mg考马斯亮蓝G250,溶于200ml蒸馏水中,慢慢加入7.5ml 70%的过氯酸,最后补足水到250ml,搅拌1小时,小孔滤纸过滤。

器材:电泳仪 ,电泳槽,水浴锅,摇床。

三. 实验操作;

1. 样品制备

将蛋白质样品与5X样品缓冲液(20ul+5ul)在一个Eppendorf管中混合。放入100℃加热5-10min,取上清点样。

2. 分离胶及浓缩胶的制备

① 将玻璃板、样品梳、Spacer用洗涤剂洗净,用ddH2O冲洗数次,再用乙醇擦拭,晾干;

② 将两块洗净的玻璃板之间加入Spacer,按照Bio-Rad Mini Ⅱ/Ⅲ说明书提示装好玻璃板;

③ 按如下体积配制10%分离胶8.0 ml,混匀:ddH2O 3.0 ml;1.0 mol/LTris-HCl pH=8.8 2.1 ml;30% Acr-Bis 2.8 ml;10% SDS 80 ul;10%AP 56 ul;TEMED 6 ul。

④ 向玻璃板间灌制分离胶,立即覆一层重蒸水,大约20 min后胶即可聚合;

⑤ 按如下体积配制6%浓缩胶3.0 ml,混匀:ddH2O 1.0 mol/LTris-HClpH=6.8 30% Acr-Bis;2.0 ml 400 ul 600 ul;10% SDS 10% AP TEMED;36ul 24ul 4ul。

⑥ 将上层重蒸水倾去,滤纸吸干,灌制浓缩胶,插入样品梳;

⑦ 装好电泳系统,加入电极缓冲液,上样20 μl;

⑧ 稳压200V,溴酚蓝刚跑出分离胶时,停止电泳,约需45 min~1hr.

⑨ 卸下胶板,剥离胶放入染色液中,室温染色1~2 hr;加入脱色液,置于80 rpm脱色摇床上,每20 min更换一次脱色液(10 ml 冰乙酸;45 ml乙醇;45 ml蒸馏水)至完全脱净。

聚丙烯酰胺凝胶具有分子筛效应,可根据蛋白亚基分子量不同将分离蛋白,SDS-PAGE电泳凝胶好坏直接关系到电泳能否成成,一般浓缩胶和分离胶的pH分别是6.7和8.9.

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