双向电泳的实验相关试剂配制

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所属分类:蛋白质组学

1.        Bradford 工作液
95%乙醇             25ml       先用乙醇溶解考马斯亮兰G250,溶解完后再加磷
85%磷酸             52ml       酸,最后超纯水定容至500ml。过滤后置于棕色瓶
考马斯亮兰G250      0.035g     外加油皮纸保存(Bradford不稳定,一周内有效)
2.        裂解液
尿素                 8M
硫脲                 2M
CHAPS               4%
DTT                 60 mM
Tris―base            40 mM(如果有条件可以添加PMSF 0.5mM和5%的Pharmalate)
3.        水化液储液
尿素                 8M
硫脲                 2M
CHAPS               4%
Tris―base            40 mM
4.        分离胶buffer (pH8.8)                         250ml
SDS                  0.4%                   1g
Tris―HCl             1.5M                 45.4275g
5.        浓缩胶buffer (pH6.8)                         100ml
SDS                  0.4%                  0.4g
Tris―HCl             0.5M                  6.07g
6.        凝胶储存液(30%的丙烯酰胺)               250ml
Acr                  29.2%                  73g
Bis                   0.8%                   2g
7.        电极缓冲液(跑一次要配制2500ml)
甘氨酸               43.2g                  36g
Tris                  9g         或           7.5g
SDS                 3g                     2.5g               
超纯水定容至3000ml                         超纯水定容至2500ml
8.        0.5M Tris ―HCl pH 6.8储液
6.1g Tris先用30ml超纯水溶解,再用46ml,3M HCl调pH6.8,再加水定容至100ml
9.        平衡液储液
脲(即尿素)         36g
甘油                 30%                  30ml
SDS                  1%                   1g
0.5M Tris―HCl pH6.8  10ml              超纯水定容至100ml
10. 平衡液A(一根胶条)
DTT                 20mg
平衡液储液           10ml
11.平衡液B(一根胶条)
碘乙酰氨             300mg
平衡液储液           10ml
0.05%溴酚兰          15ul              (平衡液A、B均需临时配制)
12.0.5%琼脂糖10ml
琼脂糖               0.05g
电极缓冲液           10ml
溴酚兰               25ul
补:4、5、6的溶液需过滤后储存于4OC备用。
C.        药品
CHAPS          兼性离子去垢剂    去垢剂可破坏蛋白质分子之间的疏水相互作用,
SDS            离子型去垢剂       提高蛋白质的溶解性,防止在等电聚焦时析出

尿素            离液剂             可改变或破坏氢键等次级键的结构,使蛋白质
硫脲            离液剂             变性并使蛋白失活。尿素和硫脲联合使用,可
                                   以大大增加蛋白质的溶解性

DTT            还原剂             断裂蛋白质分子中Cys残基之间形成的二硫键,增加蛋白质的溶解性。但过分提高DTT的浓度,由于它pKa在8左右,因而会影响pH梯度。DTT在碱性pH下会去质子化,等电聚焦时会损耗,导致二硫键复原,蛋白质沉淀

BSA                               Bradford中制作标准曲线用
无水乙醇                           和磷酸一起,提供Bradford中的环境
磷酸                               提供Bradford中的酸性环境
Tris                                构成缓冲液的成分,可用于抗衡pH的变化
IPG buffer
覆盖液                             即矿物油,防止水分蒸发,样品干燥。

丙烯酰胺(Acr)                     以丙烯酰胺为单体,甲叉二丙烯酰胺为交联剂,
甲叉二丙烯酰胺 (Bis)              在催化剂(Aps)和引发剂(TEMED)作用下,聚合交联成三维网状结构

琼脂糖
溴酚兰                            指示剂作用
碘乙酰氨(IAA)                   平衡液B中使用,中和A液中的DTT
正丁醇                          比聚丙烯酰胺密度小,用于凝胶制作过程中的压胶
甘油                               无机盐的良好溶剂,热稳定性好
Marker
考马斯亮兰G250(Bradford法用)    考马斯亮兰G250有红、蓝两种不同颜色的形式在一定浓度的乙醇及酸性条件下,可配成淡红色的溶液,当与蛋白结合后,产生蓝色化合物,反应迅速而稳定,反应化合物在465~595nm处有最大的光吸收值,化合物颜色 深浅与蛋白浓度的高低成正比关系,因此可检测595nm的光吸收值的大小计算蛋白的含量
甘氨酸                             与Tris构成缓冲系统
AgNO3
EDTA                              金属螯合剂,可以结合银离子,终止银染过程

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