聚丙烯酰胺凝胶电泳PAGE胶的制备过程

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所属分类:蛋白质组学
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聚丙烯酰胺凝胶电泳 可用于蛋白和寡核苷酸的分离,最常用于蛋白质的分离,这里总结了DNA电泳专用的各种浓度PAGE胶配制的配方及制备方法。

聚丙烯酰胺 凝胶电泳简称为PAGE(Polyacrylamide gel electrophoresis),是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质。聚丙烯酰胺凝胶是由单体的丙烯酰胺(CH2=CHCONH2 Acrylamide)和甲叉双丙烯酰胺(CH2(NHCOHC=CH2) 2 N,N'-methylenebisacrylamide)聚合而成,这一聚合过程需要有自由基催化完成。

各种浓度PAGE胶的配制(DNA电泳用)

50ml体系:

丙烯酰胺 有效分离(bp) 二甲苯青 溴酚蓝 丙烯酰胺30%(ml) 10×TBE(ml) ddH2O(ml) TEMED(µl) 过硫酸铵10%(µl) 3.5% 100-1000 460 100 5.83 5 39.17 25.0 250 5.0% 100-500 260 65 8.33 5 36.67 25.0 250 8.0% 60-400 160 45 13.33 5 31.67 25.0 250 12.0% 40-200 70 20 20.0 5 25.00 25.0 250 15.0% 25-150 60 15 25.0 5 20.00 25.0 250 20.0% 5-100 45 12 33.33 5 11.67 25.0 250

5ml体系:

丙烯酰胺 丙烯酰胺30%
(ml)
10×TBE
(ml)
ddH2O
(µl)
TEMED
(µl)
过硫酸铵10%
(µl)
3.5% 0.583 0.5 3.917 2.5 25 5.0% 0.833 0.5 3.667 2.5 25 8.0% 1.333 0.5 3.167 2.5 25 12.0% 2.00 0.5 2.5 2.5 25 15.0% 2.50 0.5 2.0 2.5 25 20.0% 3.333 0.5 1.167 2.5 25

1、丙烯酰胺30%为29:1(质量比,丙烯酰胺:双甲叉丙烯酰胺)

2、TEMED 可以加到1ul/ml。

不同浓度丙烯酰胺和DNA的有效分离范围表

丙烯酰胺(%) 有效分离范围(bp) 溴酚兰* 二甲苯青* 3.5 100~2000 100 460 5.0 80~500 65 260 8.0 60~400 45 160 12.0 40~200 30 70 15.0 25~150 15 60 20.0 10~100 12 45

*表中给出的数字为与指示剂迁移率相等的双链DNA分子 所含碱基对数目(bp).

凝胶的制备过程:

1、 按要求装配好垂直电泳板,两块玻璃板的两侧及底部用1%的琼脂糖封边,防止封闭不严而使聚丙烯酰胺液漏出。

2、 将装好的玻璃电泳板倾斜成45~60℃角。

3、 按表3配制所需%浓度凝胶的毫升数。

4、 加入TEMED后,立即混匀,缓缓倒入两玻璃板间的胶床中,直到液体接近溢出时为止。

5、 立即插入适当的梳子,密切注意防止梳齿下产生气泡,用一有力的夹将梳子夹在一边的玻璃板上,然后将玻璃板斜靠在物体上,使成10°角,可减少液体泄漏的机会。

6、 室温聚合一小时后,将玻璃板插入电泳槽中,上紧,倒入0.1XTBE缓冲液。

7、 小心取出梳子,加样。

大家可以根据自己试验中DNA片段大小的不同选择配制合适浓度的丙烯酰胺胶。PAGE胶配制过程中记得避免气泡的产生。

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