DNA的琼脂糖凝胶电泳简介

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所属分类:蛋白质组学

琼脂糖凝胶电泳对核酸的分离作用主要是依据它们的相对分子量质量及分子构型,同时与凝胶的浓度也有密切关系。
1 、核酸分子大小与琼脂糖浓度的关系
(1 )DNA 分子的大小 在凝胶中,DNA 片段迁移距离(迁移率)与碱基对的对数成反比,因此通过已知大小的标准物移动的距离与未知片段的移动距离时行比较,便可测出未知片段的大小。但是当DNA 分子大小超过20kb 时,普通琼脂糖凝胶就很难将它们分开。此时电泳的迁移率不再依赖于分子大小,因此,就用琼脂糖凝胶电泳分离DNA 时,分子大小不宜超过此值。
(2 )琼脂脂糖的浓度 如下表所示,不同大小的DNA 需要用不同浓度的琼脂糖凝胶进行电泳分离。

         表 琼脂糖浓度与DNA 分离范围
琼脂糖浓度 /%    0.3    0.6    0.7    0.9    1.2    1.5    2.0
线状DNA 大小
/kb  60-5  20-1  10-0.8  7-0.5  6-0.4  4-0.2  3-0.1

2 、核酸构型与琼脂糖凝胶电泳分离的关系
     不同构型DNA 的移动速度次序为:供价闭环DNA (covalently closed circular ,cccDNA )> 直线DNA> 开环的双链环状DNA 。当琼脂糖浓度太高时,环状DNA (一般为球形)不能进入胶中,相对迁移率为0 (Rm=0 ),而同等大小的直线双链DNA (刚性棒状)则可以长轴方向前进(Rm>0 ),由此可见,这三种构型的相对迁移率主要取决于凝胶浓度,但同时,也受到电流强度、缓冲液离子强度等的影响。
3 、电泳方法
(1 )凝胶类型
     用于分离核酸的琼脂糖凝胶电泳可分为垂直型及水平型(平板型)。水平型电泳时,凝胶板完全浸泡在电极缓冲液下1-2mm ,故又称为潜水式。目前更多用的是后者,因为它制胶和加样比较方便,电泳槽简单,易于制作,又可以根据需要制备不同规格的凝胶板,节约凝胶,因而较受欢迎。
(2 )缓冲液系统
     缺少离子时,电流太小,DNA 迁移慢;相反,高离子强度的缓冲液由于电流太大会大量产热,严重时,会造成胶熔化和DNA 的变性。
常用的电泳缓冲液有EDTA (pH8.0 )和Tris- 乙酸(TEA ),Tris- 硼酸(TBE )或Tris- 磷酸(TPE )等,浓度约为50mmol/L(pH7.5~7.8) 。电泳缓冲液一般都配制成浓的贮备液,临用时稀释到所需倍数。
TAE 缓冲能力较低,后两者有足够高的缓冲能力,因此更常用。TBE 浓溶液长期贮存会出现沉淀,为避免此缺点,室温下贮存5× 溶液,用时稀释10 倍0.5× 工作溶液即能提供足够缓冲能力。
(3 )凝胶的制备
     以稀释的电极缓冲液为溶剂,用沸水浴或微波炉配制一定浓度的溶胶,灌入水平胶框或垂直胶膜,插入梳子,自然冷却。
(4 )样品配制与加样
    DNA 样品用适量Tris-EDTA 缓冲液溶解,缓冲液内含有0.25% 溴酚蓝或其他指示染料,含有10%-15% 蔗糖或5%~10% 甘油,以增加其比重,使样品集中。 为避免蔗糖或甘油可能使电泳结果产生U 形条带,可改用2.5%Ficoll (聚蔗糖)代替蔗糖或甘油。
(5 )电泳
     琼脂糖凝胶分离大分子DNA 实验条件的研究结果表明,在低浓度、低电压下,分离效果较好 。在低电压条件下,线性DNA 分子的电泳迁移率与所用的电压呈正比。但是,在电场强度增加时,较大的DNA 片段迁移率的增加相对较小。因此随着电压的增高,电泳分辨率反而下降,为了获得电泳分离DNA 片段的最大分辨率,电场强度不宜高于5V/cm
     电泳系统的温度对于DNA 在琼脂糖凝胶中的电泳行为没有显著的影响。通常在室温下进行电泳,只有当凝胶浓度低于0.5% 时,为增加凝胶硬度,可在4℃ 进行电泳。
(6 )染色和拍照
     常用荧光染料溴乙锭(EB )染色,在紫外光下观察DNA 条带,用紫外分析仪拍照,或用凝胶成像系统输出照片,并进行有关的数据分析。

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