ZOOM® IPGRunner™系统:简化的双向电泳(2D gel eletrophoresis)

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所属分类:蛋白质组学

摘要 双向电泳(Two-dimensional(2D) gel electrophoresis)是一项基于蛋白的两种不同特性:电荷和质量来分离蛋白的技术。首先基于蛋白固有电荷,通过等电聚焦(isoelectric focusing IEF)进行第一向蛋白分离,然后根据蛋白的质量,在第二向中通过SDS-PAGE电泳进行蛋白分离。使用这两种不同的分离技术的结果是增高了对蛋白的分辨率。传统的2D技术费用高昂、操作烦琐和耗费时间。ZOOM® IPGRunnerTM系统提供了进行第一向等电聚焦简单而快速的方法,无需使用矿物油。使用7cm ZOOM®固定pH梯度胶条(immobilized pH gradient IPG strips)的第一向电泳和使用NuPAGE® Novex 4-12% Bis-Tris ZOOM® Gels的第二向电泳总共可以在3小时内完成。 前言 双向电泳(Two-dimensional(2D) gel electrophoresis)是蛋白分离的黄金标准,由此可以分析生物样品的显著差别,产生的结果用于诊断疾病、发现新的药物靶标和分析潜在的环境和药物的毒性。双向电泳分离技术利用复杂蛋白混合物中单个组分的电泳迁移,第一向通过电荷的不同分离,另一向通过质量的不同分离。双向电泳协同质谱技术是正在出现的蛋白组学领域的中心技术。 迄今为止,双向电泳技术一直是使用昂贵的专门仪器,要求大实验室的积累和专门的训练。为了保证结果的重复性,需要延长时间和技术专家的建议。 ZOOM® IPGRunner™系统提供了一种进行等电聚焦实验的新方法,大大地简化和加速了进行2D分离的进程。在一个一次性实验的夹盒(cassette)中的7cm固定pH梯度(IPG)胶条上进行等电聚焦,ZOOM® IPGRunnerTM夹盒(ZOOM® IPGRunner™ cassette)可以容纳多达6个胶条,并且不需要矿物油覆盖。胶条直接在夹盒中水化,使用一个特殊设计电泳核心的垂直电泳微槽(mini-cell)进行聚焦。仪器容易组装,不需要多少时间。使用ZOOM® IPGRunnerTM夹盒可以同时电泳多达12个胶条。仪器设计最佳电功率,聚焦时间短至1.5小时(图1)。在ZOOM®胶上进行第二向分离,ZOOM®胶上有一个蛋白标准加样孔和一个容纳7cm胶条的孔。当使用NuPAGE® Novex Bis-Tris ZOOM®胶时,第二向SDS-PAGE电泳需要花费40-45分钟(图1 )。这个体系的简洁性使初学者易于进入到2D电泳。

图1 ZOOM® IPG Runner™系统

step 步 骤 时 间 1 加样,插入IPG胶条,密封上样孔 10分钟 2 再水化胶条 过夜孵育 3 移去加样孔,放置电极芯,组装IPGRunner™ Mini-Cell 5分钟 4 进行等电聚焦 电泳90分钟 5 还原,烷基化,将胶条插入ZOOM®胶 35分钟 6 进行SDS-PAGE 电泳40分钟 7 使用SilverQuest™ Silver Staining Kit 或者SimplyBlue™ SafeStain染色 90或者45分钟 方法 第一向 IEF 在ZOOM® IPG RunnerTM夹盒(Invitrogen, Cat. no. ZM0003)中再水化ZOOM®胶条,pH4-7(Invitrogen, Cat. no. ZM0012)。IPG Runner™夹盒放置在实验台,有覆盖膜窗口的一面朝上。包括2M Thiourea, 7 M urea, 0.5% ZOOM® Carrier ampholytes (Invitrogen, Cat. no. ZM0022), 2.0% CHAPS, 20 mM DTT 的再水化缓冲液(155μl)和E. coli裂解物被加入到IPG Runner™夹盒窗口。胶条的酸性(+)末端插入狭槽,胶面朝向夹盒的膜或覆盖面。用密封带(包含在试剂盒中)封闭加样孔,提供隔绝的再水化环境。胶条在室温下再水化8-16小时。每一个IPG Runner™夹盒可以进行6个IPG 胶条电泳。再水化后,移去密封带和加样孔,在IPG Runner™夹盒的每一端放置电极芯,电极芯用750μl的去离子水润湿。通过滤纸吸去过多的水分,以便电极芯保持潮而不湿。组装夹盒和缓冲液核心(buffer core),然后插入ZOOM® IPG Runner™ Mini-cell电泳槽(Invitrogen, Cat. no. ZM0001)。在Mini-cell电泳槽的外槽加入650ml水。接通电源进行等电聚集,电流限制50μA/胶条,功率限制0.1W/胶条,电压调节步骤如下: 1 175V 15分钟
2 175-2000V 梯度 45分钟
3 2000V 30分钟 等电电泳结束后,拆散ZOOM® IPG Runner™ Mini-cell电泳槽,去除夹盒上的覆盖膜(film cover),平衡ZOOM®胶条进行第二向分析。 第二向SDS-PAGE电泳 使用NuPAGE® Novex 4-12% Bis-TrisZOOM®胶进行第二向电泳。在NuPAGE LDS样品缓冲液进行第二向平衡,缓冲液中含有还原剂和烷化剂。蛋白巯基的烷基化减少了由于SDS电泳期间二硫键的再形成和残余DTT的存在导致的垂直脱尾。ZOOM® 胶条在5ml包含50mM DTT 1X NuPAGE® LDS样品缓冲液中孵育15分钟,接下来在包含125 mM碘代乙酰胺( iodoacetamide)的1X NuPAGE® LDS样品缓冲液中孵育15分钟。然后将每一个IPG胶条放入ZOOM®胶加样孔,再加入400μl 用合适的电泳缓冲液制备的0.5%琼脂糖溶液封盖。分子量标准(Mark12™ Unstained Protein Standard, Invitrogen, Cat. no. LC5677)上样到分子量标准孔。胶条使用NuPAGE® Novex 4-12% Bis-Tris ZOOM®胶(Invitrogen, Cat. no. NP0330),按照标准程序在XCell SureLock® Mini-Cell 槽(Invitrogen, Cat. no. EI001)中进行电泳。200V 电泳45分钟。 染色 按照标准程序,使用SilverQuest™银染试剂盒(SilverQuest™ Silver Staining kit )( Invitrogen, Cat. no. LC6070)或SimplyBlue™ SafeStain (Invitrogen, Cat. no. LC6060)对2D胶进行染色。 结果和讨论 图2 是按照图1流程E. coli 裂解物电泳后胶的图。2D电泳和染色总的时间是3小时35分钟,胶用SimplyBlue™ SafeStain 染色。使用SilverQuest™试剂盒需要4小时20分钟。两块胶进行第一和第二向电泳的总的时间2小时50分钟等电聚焦时间缩短到1.5小时,总共∽1300 volt-hours,而传统的浸油系统聚焦蛋白需要2-8小时,总的6,000-20,000 volt-hours。由于ZOOM® IPG Runner™仪器消除了回路中电阻的来源,通过胶条的实施电压接近电源的实际电压输出。这个电系统的效率允许使用2000V或者更低的电压进行完全的聚焦。

图2 使用ZOOM®系统的2D胶染色 双向电泳的总的时间为2小时50分钟。SimplyBlue™ SafeStain Coomassie stain染色时间为45分钟,SilverQuest™ Silver Stain染色时间为1小时30分钟。 ZOOM® IPG Runner™系统节省时间的优点和一次性使用夹盒的方便,可以让使用者每天进行大量的第一向电泳。聚焦的后的胶条能够进行批次分析,或者贮存起来进行随后的第二向电压,夹盒需要保存在-80℃,不要去除覆盖膜。 因为IPG Runner™ Mini-Cell 槽小的占地面积,它可以在任何实验台上贮存和电泳,无需专门的IEF实验台。ZOOM® IPG RunnerTM过程的简洁性使每一个人都可以进入2D电泳技术。技能的传授和训练是简单的,将会使任何实验室的工作更加高效。 ZOOM® IPG Runner™系统满足了日常重复性的需求和2D电泳技术简洁性,这将允许每一个研究者在他们的实验台上就进入这项强大的技术。

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