DNA胶回收实验技术总结

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所属分类:蛋白质组学

 

胶回收

一. 提高胶回收量的办法:

1) 增加电泳时的上样量。

2) 电泳缓冲液用新鲜配制的。

3) 切胶时尽量只切有条带的胶,减小切胶体积:含目的片断很少的胶就不要要了,不然影响回收率。

4) 把切的两块或多块胶融化后,无论多大的体积都用一个管子,转移到同一个柱子上。

5) 溶胶时所加的溶液可多一点,这样更有利于DNA与膜的结合,不过一般不要多余750ul。

6) 胶回收的关键是通过柱子的溶液的盐浓度、酸碱性(电荷)和疏水性使DNA与柱子结合,因此,若电泳缓冲液的PH偏高,可在溶胶液中加入10ul(PH 5.0,3mol/L的 NaAC);为了使DNA分子更好的拦截在膜上,可以添加30%异丙醇在加热溶解胶后的液体里。

7) 加洗脱液之前,将柱子在室温放置几分钟(大约需10分钟),以使乙醇充分挥发。

8) 最后少加些洗脱液,尽量减少回收体积,一般用30-50μl洗脱液洗脱(不能太少,否则无法浸湿膜反而不利于洗脱);洗脱液滴在膜中央,以充分洗脱结合在膜上的DNA。

9) 可以在加入洗脱液之后,可以在55度水浴5分钟或放在50度水浴10分钟以上再洗脱,或用封口膜密封4度过夜,第二天再离心回收,效果不错。

10) 将离心后的洗脱液加回吸附柱,再次离心。

二. 几种PCR 产物回收的详方法和步骤

1) 普通胶回收

如果要胶回收,最好还是用试剂盒,方便,回收率也略高,实在要手工回收,可以切胶后加入3倍体积TE,水浴熔化后,酚、酚/氯仿抽提干净,乙醇沉淀即可。另外好像还有冷冻法,没作过,不是很清楚。

2) 从低熔点凝胶回收DNA

纯化DNA片段 加与凝胶体积相等的TE(10mmol/l Tris-HCl pH8.0,0.1mmol/l EDTA),置65℃水浴5分钟保温,使凝胶完全溶解。待放至室温,加等量酚(TE饱和,TE封在上层,取下层酚),轻轻混匀(不用混匀),12000rpm,3分钟离心。反复1-2次。取上层液,加0.1体积3mol/L醋酸钠(pH5.2)和2.5倍体积无水乙醇,进行乙醇沉淀。将纯化的DNA加适量TE溶解,测定含量,备用(可用于目的基因结构分析,探针制备等)。

3) 扩增特异性好的PCR回收

如果PCR扩增特异性好,只是简单的PCR产物纯化回收,可以在PCR产物中加入50ug/ml 的蛋白酶K,37度1h,酚/氯仿抽提一次,氯仿抽提一次,上清加入0.1体积的醋酸钠,2.5体积的无水乙醇沉淀回收。

三. 不需胶回收就可直接连接的方法

1) 低温冷冻析出法

跑电泳时用低熔点的agarose胶,跑到一定时候,将目的条带所在的那一段胶切下,尽量切干净,让核酸直接暴露在胶的表面,并且,把底下没有脱氧核酸的那点胶也尽量切掉,然后放入1.5ml EP管中,然后放在负75度冰箱中10-30分钟,接着1,300rpm离心5-10分钟,取10ul上清,加入连接体系中。将其余的液体也吸出,储存在另一个管子中,做好标记,放在-20度备用。

2) 酶切后的直接连接

在你酶切后可以直接的加入连接酶和另外的片断进行连接是可以筛选出连接好的片断的.

四、一些注意事项

1.电泳的buffer和gel都是新制的,切胶的台子清理干净,刀片最好洗净灭菌,总之一句话就是保证切下的带没有外源DNA污染。

2.切胶是要把整个目的片断所在位置的胶全部回收。为了减少胶的体积,可以用相对比较薄的胶来做,只要够点样即可,也可采用薄而宽的梳子来跑胶。

3.关于防护,在一般有机玻璃后就足够了,戴上防护面具以保护眼睛,如果你戴树脂眼镜就可以了。

4.琼脂糖对回收率有一定影响,如果琼脂糖较多,可以增加溶胶液,保证体系盐浓度。影响回收率的因素主要是柱子填料必须在适宜的缓冲环境中(如果用柱子的话)。对于小于100bp的片段回收,可加至30%异丙醇。

5.如果是用PAGE回收,用水或TE溶解,枪头捣碎,过夜浸泡,即可。当然你要将100bp在胶中位置定好切下。已标记的探针用X片,未标记的用EB。

6.选用回收效率较高的柱子,比如进口的Qiaquick spin column。

7.参照分子克隆用低熔点胶回收。除低熔点凝胶回收法外,如用一般凝胶可用透析带短暂电泳,离心管低部加玻璃棉,高速离心等方法回收DNA片段。

附注:

1.影响DNA在琼脂糖凝胶中迁移速率的因素:

1)DNA分子大小 迁移速率U与logN成反比(N为碱基对数目)。分子大小相等,电荷基本相等(DNA结构重复性)。分子越大,迁移越慢。等量的空间结构紧密的电泳快(超螺旋>线性DNA)

2) 琼脂糖浓度:logU=logU0 Krt 胶浓度,U为迁移率,U0 为DNA的自由电泳迁移率,t为胶浓度,Kr为介质阻滞系数。不同的凝胶浓度,分辨不同范围的DNA

Agarose: 0.5%: 1-30 kb; 0.7%: 0.8-12 kb

1.2%: 0.4-7 kb; 1.5%: 0.2-3 kb.

3)DNA构象:一般迁移速率超螺旋环状>线状DNA>单链开环。当条件变化时,情况会相反,还与琼脂糖的浓度、电流强度、离子强度及EB含量有关。

4)所加电压:低电压时,线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。使分辨效果好,凝胶上所加电压不应超过5V/cm

5)碱基组成与温度:一般影响不大4 -30 ℃

6)嵌入染料的存在:降低线性DNA迁移率,(不提倡加在电泳液中)

7)电泳缓冲液 (0.5×TBE)的组成及其离子强度影响DNA的迁移率,无离子存在时,核酸基本不泳动,离子强度过大产热厉害,熔化凝胶并导致DNA变性,一般采用1×TAE,1×TBE,1×TPE(均含EDTA pH8.0)。

2.溴化乙锭(EB)为致癌剂,操作时应戴手套,尽量减少台面污染。

3.电泳指示剂:核酸电泳常用的指示剂有两种,溴酚蓝(bromophenol blue, Bb)呈蓝紫色;二甲苯晴(xylene cyanol, Xc)呈蓝色,它携带的电荷量比溴酚蓝少,在凝胶中的的迁移率比溴酚蓝慢。

 

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