蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳的操作方法

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所属分类:蛋白质组学
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【材料与试剂】

(1)2×SDS凝胶加样缓冲液

(2)聚丙烯酰胺凝胶电泳槽和电泳仪

(3)加样器和吸头等

(4)水浴锅

【操作方法】

(1) 把上述处理的样品按1:1(V/V)与2×SDS凝胶加样缓冲液混合,100℃加热3分钟,使蛋白质变性;

(2) 取出变性蛋白质,立即放于冰上。样品如粘稠可进行超声对DNA进行剪切,以最大功率处理0.5~2分钟应能有效地将裂解液粘稠度降至可控水平(注意:此步骤一定要在冰上进行);

(3) 如有沉淀以10 000g将样本4℃离心10分钟,将上清液移至另一管中,弃去沉淀物;

(4) 计算使用Western印迹法检测靶蛋白所需要的样本量,一般Western印迹法技术检测中等大小蛋白的检出下限约为1~5ng。在厚0.75mm的SDS丙烯酰胺 凝胶上,每个泳道可加样100μg而不致过多;

(5) 用玻璃微量进样器按顺序加样,注意沿加样孔底上样,否则样品容易漂走。加样量不宜过多或过少,一般15~20ul为宜。没上样的加样孔中加1?SDS凝胶加样缓冲液;

(6) 用注射器排除两玻璃板底部的气泡,将电泳装置接通电源(正极接下槽,负极接上槽),凝胶上所加电压为8v/cm,当溴酚蓝前沿进入分离胶后,电压可提高到15V/cm,继续电泳直至溴酚蓝到达分离胶底部(约4小时),关闭电源;

(7) 从电泳装置上卸下玻璃板,放入一瓷盘中,用一注射器吸取若干毫升电泳缓冲液,将针头插入一玻璃板与凝胶之间,小心不要将凝胶刺破,沿玻璃板从左至右注入电泳缓冲液,将玻璃板与凝胶分开。靠近左边切去一角以标明凝胶的位置;

(8) 如不需做免疫 检测可直接用考马斯亮蓝染色,做免疫检测可按以下步骤进行。

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