聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定IgG纯度操作方法

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所属分类:蛋白质组学
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(一)原 理

由于聚丙烯酰胺凝胶的浓度可以按要求配制,因此可以形成“连续系统”和“不连续系统”两种电泳系统。“不连续系统”最大的特点在于大大提高了样品分离的分辨率。这种电泳的主要特点是:(1)使用两种不同浓度的凝胶系统;(2)配制两种凝胶的缓冲溶液成分及pH不同,并且与电泳槽 中电泳缓冲液的成分、pH也不相同。在实验中,电泳凝胶分为两层:上层胶为低浓度的大孔胶,称为浓缩胶或成层胶,配制此层胶的缓冲液是Tris-HCl,pH6.7;下层胶则是高浓度的小孔胶,称为分离胶或电泳胶,成胶的缓冲液是Tris-HCl,pH8.9。电泳槽中的电极缓冲液则是Tris-甘氨酸,pH8.3。可见,凝胶浓度、成胶成分、pH与电泳液缓冲系统各不相同,形成了一个不连续系统。

电泳时,蛋白质样品放置在浓缩胶上,为防止蛋白质样品在电极缓冲液中扩散,因而加入等体积的40%蔗糖或50%甘油与之混合,以提高密度;为观察蛋白质样品泳动的情况,样品中还加入溴酚蓝等示踪染料,这些有色物质的分子 比任何一种大分子物质泳动的速度都快,只要染料未泳动出凝胶管,样品就没有走出胶管的危险。

在不连续系统中,当接通电源开始电泳时,系统中的甘氨酸、蛋白质、HCl中的氯离子和溴酚蓝等均解离为阴离子,形成离子流向阳极泳动。其迁移率取决于离子的电荷数、分子量大小及形状。然而,当电极缓冲液(pH8.3)中的甘氨酸离子在进入浓缩胶时,它们遇到了比pH8.3低的pH(6.7),pH下降了近两个单位,几乎接近于甘氨酸的等电点(5.97),于是甘氨酸的解离度突然降低,所带电荷量明显减少,迁移率减慢。血清样品中个蛋白质成分也进入浓缩胶,pH的改变虽对其解离度有影响,但比对甘氨酸要小得多,其迁移率比甘氨酸要大,而且浓缩胶的胶孔较大对蛋白质分子不会造成阻碍。浓缩胶中的Tris-HCl中的Cl-则全部解离,分子量很小,摩擦力不大,其迁移率比蛋白质、溴酚蓝都快。于是在浓缩胶中各种离子的迁移率形成:甘氨酸<蛋白质<溴酚蓝

甘氨酸分子进入浓缩胶后解离度的下降,造成移动离子流的突然缺失,出现电流减小电导率下降。然而,整个电泳系统中其他部分的电流仍维持不变,根据电导及电位梯度成反比(E=I/n,E为电位梯度,I为电流强度,n为电导率)的关系,于是在前导离子Cl-离子与慢离子甘氨酸离子之间突然形成了较高的局部电位梯度。处在这个局部高电位梯度区域中的血清蛋白质各成分,在高电场作用下迅速以不同的速度(分子量不同、带电量不同)泳向前导Cl-离子区域。当到达前导Cl-区域时因不缺少离子,大的电场强度减弱,离子移动速度急速减慢下来,其结果在甘氨酸和Cl-离子之间的蛋白质样品就按其分子的大小堆积或浓缩成层。通过这个过程,是蛋白质样品浓缩了好几百倍,且蛋白质各成分也按一定的顺序排列成层。

当离子流继续向前,进入以pH8.9缓冲液配制的小孔胶时,蛋白质分子在小孔胶里遇到阻力,迁移率减慢,同时在pH8.9条件下,甘氨酸又充分解离,其带电量增加,消除了离子流缺失的现象,小分子 的甘氨酸离子赶上了蛋白质。凝胶各部分恢复具有恒定的电场强度,蛋白质的分离完全按一般区带点用方式进行。

由以上的原理可见,聚丙烯酰胺凝胶的不连续电泳最主要的优点就是使蛋白质样品经浓缩胶后,形成紧密地压缩层进入分离胶。蛋白质各成分预先分开且压缩成层,可以减少在电泳时,成分间由于自由扩散而造成的区带相互重叠所带来的干扰,这样就提高了电泳的分辨能力。由于这个优点,少量的蛋白质样品(1-100??g)也能分离得很好,分辨率高使血清蛋白质可获得近20多个区带。

聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定IgG纯度操作方法

(二)试剂和器材

1.测试样品 血清蛋白、脱盐后的IgG、纯化后的IgG。

2.试剂

(1)制备分离胶、浓缩胶有关试剂

① 凝胶缓冲液:称取1mol/L HCl 48ml,Tris(三羟基氨基甲烷)36.6g,TEMED(N,N,N`,N`-四甲基乙二胺)0.23ml,加重蒸水至80ml使其溶解,调pH8.9,然后加重蒸馏水定容至100ml,置棕色瓶,4℃贮存。

② 分离胶贮液:28%Arc-0.735%Bis储液:丙烯酰胺(Acr)28.0g,甲叉双丙烯酰胺(Bis)0.735g,加重蒸水使其溶解后定容至100ml。过滤后置棕色试剂瓶中,4℃ 贮存,一般可放置1个月左右。

③ 分析纯过硫酸胺(AP)(AR) 0.14g加重蒸水至100ml,置棕色瓶,4℃储存仅能用一周,最好当天配制。上述3种试剂用于制备分离胶。

④ 浓缩胶缓冲液:称取1mol/L HCl 48ml,Tris5.98g,TEMED 0.46ml,加重蒸水至80ml,调pH6.7,用重蒸水定容至100ml,置棕色瓶内,4℃贮存。

⑤ 浓缩胶贮液:称Acr10g,Bis2.5g 加重蒸水溶解后定容至100ml,过滤后置棕色瓶内,4℃贮存。

⑥ 40%蔗糖溶液(W/V)

⑦核黄素溶液 核黄素4.0mg,加重蒸馏水溶解,定容至100ml,置棕色试剂瓶内,4℃贮存。

(2)Ph8.3 Tris-甘氨酸电极缓冲液

称Tris6.0g,甘氨酸28.8g,加蒸馏水至900ml,调pH8.3后,用重蒸水定容至1000ml,置试剂瓶中,4℃贮存,临用前稀释10倍。

(3)0.1%溴酚蓝指示剂

(4)染色液 染色液种类较多,染色方法也不完全相同。本实验采用0.05%考马斯亮蓝R250染色液中,含20%磺基水杨酸,其优点是染色、固定同时进行,背景易脱色。0.5%考马斯亮蓝R250的20%磺基水杨酸染色液:考马斯亮蓝0.05g,磺基水杨酸20g,加蒸馏水至100ml,过滤后置试剂瓶内保存。

(5)脱色液 7%乙酸溶液

(6)保存液 甘油10ml,冰乙酸7ml,加蒸馏水至100ml。

(7)1%琼脂(糖)溶液 琼脂(糖)1g,加已稀释10倍的电极缓冲液,加热溶解,4℃贮存,备用。

3.器材 电泳仪 夹心式垂直板电泳槽。

(三)操作方法

1.安装夹心式垂直板电泳槽

夹心式垂直板电泳槽操作简单,不易渗漏。这种电泳槽两侧为有机玻璃制成的电极槽,两个电极槽中间夹有一个凝胶模,该模由一个上框形凝胶框、长与短玻璃板及样品槽模板(梳子)所组成。电泳槽由上储槽(白金电极在上或面对短玻璃板),下储槽(白金电极在下或面对长玻璃板)和回纹状冷凝管组成。两个电极槽与凝胶模间靠储液槽螺丝固定。各部间依下列顺序组装:

(1)将上储槽和固定螺丝销钉,仰放在桌面上。

(2)将上、短玻璃板分别插到上框形硅橡胶的凹形槽中。注意勿用手接触灌胶面的玻璃。

(3)将已插好玻璃板的凝胶模平放在上储槽上,短玻璃板应面对上储槽。

(4)将下储槽的销孔对准已装好螺丝销钉的上储槽 ,双手以对角线的方式旋紧螺丝帽 。

(5)竖直电泳槽,在长玻璃板下端与硅胶模框交界的缝隙内加入已融化的1%琼脂(糖)。其目的是封住空隙,凝固后的琼脂(糖)中应避免有气泡。

2.配胶

① 分离胶 20ml pH8.9 7.0 %PAA溶液中,凝胶缓冲液(pH8.9)2.5ml,分离胶贮液5.0ml,重蒸馏水2.5ml,充分混匀,抽气10min,最后加AP 10 ml。

② 浓缩胶 pH6.7 25% PAA:浓缩胶缓冲液∶浓缩胶贮液∶40%蔗糖溶液∶核黄素溶液按1∶2∶4∶1的比例混合。

3.制备凝胶板

不连续体系采用不同孔径及pH的分离胶与浓缩胶 ,凝胶制备应分2步进行。

① 分离胶的制备:根据实验要求,选择最终丙烯酰胺的浓度,本实验需20ml pH8.9 7.0 %PAA溶液,其加胶方式不同于连续系统。混合后的凝胶溶液,用细长头的滴管加至长、短玻璃板间的窄缝内,加胶高度距样品模板梳齿下缘约1cm。用1cm注射器在凝胶表面沿短玻璃板边缘轻轻加一层重蒸水(约3-4mm)用于隔绝空气,使胶面平整。为防止渗漏,在上、下储槽中加入略低于胶面的蒸馏水。约30-60min凝胶完全聚合,则可看到水与凝固的胶面有折射率不同的界线。用滤纸条吸去多余的水,但不要碰破胶面。如需预电泳,则上、下储槽的蒸馏水倒去,换上分离胶缓冲液,10mA电流电泳1h,终止电泳后,弃去分离胶缓冲液,用注射器取浓缩胶缓冲液洗涤胶面数次,即可制备浓缩胶。

② 浓缩胶制备:浓缩胶为pH6.7 25% PAA,混合均匀后用细长的滴管将凝胶溶液加到长、短玻璃板的窄缝内(即分离胶上方),距短玻璃板上缘0.5cm处,轻轻加入样品槽模板。在上、下储槽中加入蒸馏水,但不能超过短玻璃板上缘。在距离电极槽10cm处,用日光灯或太阳照射,进行光聚合,但不要造成大的生温。在正常情况下,照射6-7min,则凝胶由蛋黄透明变成乳白色,表明聚合作用开始。继续光照30min,使凝胶聚合完全。光聚和完成后放置30-60min,轻轻取出样品槽模板,用窄条滤纸吸去样品凹槽中多余的液体,加入稀释10倍pH8.3的Tris-甘氨酸电极缓冲液。使液面没过玻璃板约0.5cm,即可加样。

4.加样

作为分析用的PAGE加样量仅需几微克,2-3ul血清电泳后就能分出几十条蛋白区带。为防止样品扩散,应在样品中加入等体积40%蔗糖(内含少许溴酚兰)。用微量注射器取5ul上述混合液,通过缓冲液,小心地将样品加到凝胶凹形样品槽底部,待所有凹形样品槽内都加了样品,即可开始电泳。

5.电泳

将直流稳压电泳仪的正极与下槽连接,负极与上槽连接(方向切勿接错)。接通冷却水,打开电泳仪开关,开始时将电流调至10 mA 。待样品进入分离胶时将电流调至20-30mA。当蓝色染料迁移至距离橡胶框下缘1cm时,将电流调回到零,关电源及冷却水。分别收集上、下贮槽电极缓冲液置试剂瓶中,4℃贮存还可用1-2次。旋松固定螺丝,取出硅橡胶框,用不锈钢铲轻轻将一块玻璃板撬开移去,在胶板一端切除一角作为标记,将胶板移至大培养皿中染色。

6.固定,染色

本实验采用0.05%考马斯亮蓝R250(内含20%磺基水杨酸)染色液,染色与固定同时进行,使染色液没过胶板,染色30min左右。

7.脱色

用7%乙酸侵泡漂洗数次,直至背景蓝色褪去。如用50℃水浴或褪色摇床,则可缩短褪色时间。脱色液经活性碳脱色后,可反复使用。

(四)注意事项

1.制备凝胶应选用高纯度得试剂,否则会影响凝胶聚合与电泳效果。Acr及Bis是制备凝胶得关键试剂,如含有丙烯酸或其它杂质,则造成凝胶聚合时间延长,聚合不均匀或不聚合,应将它们分别纯化后方能使用。Acr及Bis均为神经毒剂,对皮肤有刺激作用,实验表明对小鼠得半致死量为170mg/kg,操作应在通风中进行。Acr的纯化:称70gArc溶于1000ml 50℃预热的氯仿中,溶解后趁热过滤。冷却后,置-20℃低温冰箱中,则有白色结晶析出,用预冷的布氏漏斗抽滤,收集白色结晶,再用预冷的氯仿淋洗几次,真空干燥后置棕色瓶中密封储存。Acr的熔点为84.5+0.3。纯Acr水溶液pH应是,其pH值变化不大于0.4pH单位就能使用。Bis的纯化:称12gBis,使其溶于1000ml预热40-50℃ 的丙酮中,趁热过滤。冷却后,置-20℃ 低温冰箱中,待结晶析出后,用预冷的布氏漏斗抽滤,收集结晶,用预冷丙酮洗涤数次,真空干燥后置棕色瓶阿訇密封保存,Bis熔点为185℃。Acr和Bis的储液在保存过程中,由于水解作用而形成丙烯酸和NH3,虽然溶液放在棕色试剂瓶中,4℃储存能部分防止水解,但也只能储存1-2个月,可测pH值(4.9-5.2)来检查试剂是否失效。

2.由于与凝胶聚合有关的硅橡胶条、玻璃板表面不光滑洁净,在电泳时会造成凝胶板与玻璃或硅橡胶条剥离,产生气泡或滑胶;剥交时凝胶板易断裂,为防止次现象,所以器材应严格地清洗。硅橡胶条的凹槽、样品槽模板及电泳槽用泡抹海绵蘸取“洗洁净”仔细清洗。玻璃板侵泡在重铬酸钾洗液3-4h或0.2mol/LKOH的酒精溶液中20min以上,用清水洗净,再用泡沫海绵蘸取“洗洁净”反复刷洗,最后用蒸馏水冲洗,直接阴干或用乙醇冲洗后阴干。

3.安装电泳槽和镶有长、短玻璃的硅橡胶框时,位置要端正,均匀用力旋转紧固定螺丝,以免缓冲液渗漏。样品槽模板梳齿应平整光滑。

4.用琼脂(糖)封底及灌凝胶时不能有气泡,以免影响电泳时电流的通过。

5.凝胶完全聚合后,必须放置30min-1h,使其充分“老化”后,才能轻轻取出样品槽模板,切勿破坏加样凹槽底部的平整,以免电泳区带扭曲。

6.为防止电泳后区带拖尾,样品中盐离子强度应尽量低,含盐量高的样品槽可用透析法或凝胶过滤法脱盐。最大加样量不得超过100ug蛋白/100ul。

7.在不连续电泳体系中,预电泳只能在分离胶聚合后进行,洗净胶面后才能制备脓缩胶。浓缩胶制备后, 不能进行预电泳,以充分利用浓缩胶的浓缩效应。

8.电泳时,电泳仪与电泳槽间正、负极不能接错,以免样品反方向泳动,电泳时应选用合适的电流、电压、过高或过低均可影响电泳效果。

9.电泳后,应分别收集上下储槽电极缓冲液,在冰箱储存,可用2-3次。为保证电泳结果满意,最好用新稀释的缓冲液。

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