SDSPAGE检测检测蛋白表达的实验操作步骤

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所属分类:蛋白质组学
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一、材料与仪器

30%丙烯酰胺溶液;1.5mol/L Tris-HCl分离胶缓冲液,PH8.8;1.0mol/L Tris-HCl浓缩胶缓冲液,PH6.8;电泳缓冲液,PH8.3;10%SDS溶液;10%过硫酸铵溶液;样品处理液;染色液;脱色液;电泳玻璃板,电泳电源架,电泳槽,电泳仪 等;蛋白Mark。

二、方法与步骤

1) 分离胶和浓缩胶配制

按下表比例分别配制分离胶和浓缩胶:

表2-7:聚丙烯酰胺 组成

试剂 :

体积(ml)

 

分离胶

浓缩胶

H2 O

2.8

3.4

Acrgl-bis

4.5

0.83

Tris-Hcl

2.5(pH8.8)

0.63(pH6.8)

SDS(10%)

0.100

0.050

Ap(10%)

0.100

0.050

TEMED

5μl

5μl

2)凝胶板的准备

a) 洗板:

将洗洁精用温水稀释后,用它浸透海绵擦洗二块玻璃板,然后用自来水洗净,再用酒精将板擦干。

b)配板:

将二块玻璃板叠放整齐,用夹子两边夹好,下沿两边角可用凡士林封住缝隙,将这二块玻璃板固定在底座上。插入配套梳子,在梳子下缘划线,指示灌胶位置。拔去梳子。

3) 灌胶

a)分离胶:

在分离胶的配置烧杯中按表2-7加料,混匀后利用滴管将分离胶(避免气泡产生)滴入二块玻璃板之间,至液面达到梳子下缘1cm处。用滴管缓慢加入水,注意不要冲乱胶面。静置,待分离胶聚合后,倒去或用滤纸吸去水层。

b) 浓缩胶:

在浓缩胶的配置烧杯中按配比加料,混匀后即刻用滴管加浓缩胶(避免气泡产生)覆于二块玻璃板之间的分离胶之上至满,轻轻插入梳子。静置待其凝结后,即制成凝胶板。用笔在梳子形成的凝胶凹口部位作好记号,指示样品点入时位置。

4)样品处理

取样:2ml(2管,1ml / 管)

a)工程菌:诱导前培养2.5h 每瓶加入180µl的IPTG诱导剂,诱导培养2h 取样:2ml(2管,1ml / 管)

b)样品6000转离心10 min,收获包含体

c)完全倒干,诱导前样品:一管中加入30µl双蒸水,打散后加入另一管中,打散;

d) 诱导后样品:一管中加入50µl双蒸水,打散后加入另一管中,打散

e)等体积加loading buffer:诱导前加30µl , 诱导后加50µl

f)沸水浴10 min,煮完后以15000转离心10 min,取上清液走电泳

g)对照菌同样操作

h)样品及mark和loading buffer都各取15µl点样,点样顺序按;对照菌诱导后、对照菌诱导前、工程菌诱导前、工程菌诱导后,一起走电泳的两组间点mark,最右边的泳道点loading buffer,走SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳

1) 电泳

a) 将二块玻璃板制成的凝胶板上的夹子卸去,擦掉下沿两边角的凡士林。

b) 将凝胶板垂直靠在电泳槽里的电源架上,使凝胶板的凹沿面靠向电源架。通常两块凝胶板共用一个电源架。

c) 将凝胶板与电源架按要求固定于电源槽内。按要求加入电泳缓冲液,使分别加入在两块凝胶板中间电源架内的电泳缓冲液与加入在电泳槽中的电泳缓冲液互不相通。轻轻地拔去凝胶板内的梳子。

d) 取处理后的样品液,用微量进样器吸取适量样品液,将样品液缓缓加入凝胶板内地凹口部位(样品点入处)。注意不要冲散样品。

e)用二根导线连接电泳槽与电泳仪,注意红色与黑色电极的插头和插口相配。接通电源。控制电压在浓缩胶中为70—80V,这次实验我们控制在75V,走过浓缩胶后电压调为120V。电泳时观察凝胶板上的样品溴酚蓝的色条带走至近底端1cm 时,停止电泳。关闭电源。然后从电泳槽内小心取出凝胶板。

2) 染色

a) 用刀片或薄板将凝胶板外的两块玻璃板轻轻撬开,使凝胶倾伏在其中一块玻璃板上。

b) 用刀片在凝胶上沿分离胶与浓缩胶的交接处,将分离胶切下,并在分离胶的左上角切掉一小角,以标记样品顺序。

c)然后将分离胶小心移入染色器皿中。

d)在染色器皿中加入100 ml染色液,加盖,染色3小时。

3)脱色

将染色液倒去。染色的凝胶用水漂洗数遍,沥干水后置于染色皿中,再加入100 ml脱色液,加盖,脱色至染色的凝胶经脱色后能清晰显示出蛋白条带止。

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