Western Blot中的三大问题

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想要得到一张条带清晰、没有杂带、背景干净的图片,还是具有一定挑战性的。常遇到没有条带、背景过高等问题,没关系,请看本文的问题解答

Question:我的结果是膜上一片空白,为什么呢?

A:导致这种结果的因素很多。

胶和膜放反了:如果在转印的过程中,胶和膜的位置颠倒了,那么蛋白就从胶上转移到缓冲液中,而不会到达膜上。对于标准的转印,凝胶应靠近三明治的负极,而膜对应正极。

转膜效率低:转膜效率受多种因素影响,包括蛋白的大小、凝胶中丙烯酰胺的百分比、电场强度、转印时间和缓冲液的PH值。一般来说,蛋白越大,转移的越慢。转移大蛋白最好的方法是用高的电场强度。而小蛋白长时间处于高电场强度下可能会传出转印膜。避免这个问题的方法是用0.2μm孔径的PVDF膜进行转印。如果蛋白的等电点接近缓冲液的pH值,那么这个蛋白携带的电荷很少,在电场中页几乎不移动。如果你的目的蛋白是强碱性的,那么你可以用碳酸盐(pH9.9)、CAPS(pH11)及酸性缓冲液。

在转印之后,你可以通过染胶或第二块膜来判断转印效率。为了帮助你直接监控转印效率,Bio-Rad也提供了多种预染Marker,它们在电泳以及转膜之后可直接观察到。

试剂放置太久或存放条件不正确:抗体会慢慢降解,如果反复冻融的话,它会快速降解。底物应储存在-20℃。

抗体不纯或滴度太低:一抗的浓度差异很大,应该根据经验来决定一抗的稀释度。过犹不及,太多的抗体页会阻碍抗原 与抗体的结合。一般的原则是以1:100-1:1000来稀释血清或组织培养上清,以1:1000-1:10000来稀释腹水或超免疫动物的血清。Bio-Rad的印迹级别的二抗稀释度是1:3000。

酶失活了:叠氮钠是辣根过氧化物酶的抑制剂。不要再HRP显色的western blot 中使用任何含叠氮钠的试剂。叠氮钠可以用于碱性磷酸酶结合的抗体中,而无副作用。另外,只能使用蒸馏的去离子水。

使用Tween-20洗涤:Tween-20(吐温-20)可能会干扰某些抗体-抗体相互作用,或洗去PVDF膜上的目的蛋白。尽管在洗涤时它的终浓度只有0.05%-0.1%,但仍可能会影响结合。因此除了封闭之后的第一次洗涤,其他洗涤过程中都不使用Tween-20,不过,这可能会使背景升高。

检测系统缺乏足够的灵敏度:确保蛋白的上样量在检测系统的灵敏度范围内:

辣根过氧化物酶 500pg/band

碱性磷酸酶 100pg/band

增强的碱性磷酸酶 5pg/band

胶体金 100pg/band

增强的胶体金 10pg/band

Immun-Star化学发光 10pg/band

Q:我的western blot 总是背景过高,如何解决?

应该是多因素引起的:封闭不完全、显色过度、洗涤不充分、转移缓冲液或设备有污染、抗体稀释度不对或抗体不纯。

封闭不完全:一抗或二抗只要结合到膜上,就会显色。为了避免非特异性的结合,应用封闭液孵育膜,使所有的空白位点都被封闭蛋白占有。NC膜推荐的封闭液是3%的明胶。在室温孵育1小时。明胶不能再4℃孵育,因为会凝结。如果想在低温封闭的话,可以用3%的BSA 。PVDF膜推荐的封闭液是5%的脱脂奶粉。脱脂奶粉不能与Bio-Rad生物素化的蛋白标准一起使用。脱脂奶粉浓度过高也可能会产生背景!

显色过度:显色时间的长短取决于蛋白条带的数目以及你想要的灵敏度。如果膜在显色液中放置太久,背景就会偏高。应当在蛋白条带清晰课件,而背景几乎没有货很少时,将膜及时取出。

转移缓冲液或设备污染:使用清洁剂将转印槽内外彻底清洗干净。海绵垫也一定要认真清洗。脏的海绵垫通常是污染的最主要原因。另外 ,每次转膜时的缓冲液都要是新鲜配制的。

抗体稀释度不正确:一抗的稀释度应根据抗体来源和经验来决定。一般来说,以1:100-1:1000来稀释血清或组织培养上清,以1:1000-1:10000来稀释腹水或超免疫动物的血清。Bio-Rad的印迹级别的二抗稀释度是1:3000。抗体稀释度不够,会产生非特异性的结合,带来高背景。

二抗不纯:没有交叉吸附过的二抗可能会与膜上的其他蛋白相互作用,产生杂带。

Q:在转膜的过程中,缓冲液总是很热,我该怎么办?

A: 如果缓冲液过热,它就会分解,产生更多的热量。这可是一个大问题。为了避免分解,一定要确保你的冷却设备没问题,使用的是推荐的缓冲液,而且不在过高的功率下转印。

足够的冷却的条件:在大部分情况下,都应当使用循环冷却水来进行冷却。在冷库中转印,或将转印槽放置在冰浴中都是不行的。因为大部分转印槽都是塑料做的,不能有效地散热。另外,由于胶附近的缓冲液通常是静止的,在转印过程中应搅动来维持循环。

缓冲液:转印缓冲液的离子浓度必须是已知的,来防止过热。如果离子浓度过高,电压就应该降低(恒流转印),如果是恒压转印的话,就会过热。

功率条件:转印过程中产生的热是与功率成正比的。功率是电压与电流的乘积。当缓冲液分解时,电阻下降。如果电压是恒定的,则电流上升。因此,功率上升,产生更多的热量。如果电流是恒定的,则电压和功率下降,使蛋白转移得更慢。下表就列出了推荐的缓冲液及转膜条件。

缓冲液配方 应用 低电压
适当冷却
过夜转膜 标准电压
适当冷却
转膜5h 高密度电压
冷却至0-4℃
转膜30min-1h 25mMTris
192mM甘氨酸
pH 8.3
20%甲醇 SDS-PAGE 30V,0.1A 60V,0.21A 100V,0.36A 48mM Tris
39mM 甘氨酸
pH9.2
20%甲醇 SDS-PAGE 30V,0.1A 60V,0.21A 100V,0.43A 10mM NaHCO3
3mM Na2 CO3
pH 9.9
20% 甲醇 碱性蛋白(SDS-PAGE) 10V,0.1A 20V,0.25A 30V,0.44A

Western Blot为什么必须要用内参?

要检测一个基因的表达产物是否正确,或者比较表达产物量的相对变化,首选方法是Western Blot。因为Western Blot操作相对简单方便,既可以定性分析表达产物,同时还可以指示目的蛋白量的相对变化。虽然,顺利的时候Western Blot做起来很简单,可不顺的时候也很令人心烦――做不出结果啦、假阳性啦、结果出现多条带啦、到底是一抗有问题还是二抗有问题啦……毕竟,作为一种有活性的生物大分子,抗体和抗原的反应毕竟不象1+1那么明确,而用这种不确定的试剂来测定同样知之甚少的表达产物,确实是有一定的不确定性的。所以,严谨的Western Blot实验设计中要求有良好的参照体系,对实验结果分析是非常有用。特别是当实验出现问题时,借助参照体系很容易就可以查出问题所在,而不必抓耳挠腮怨天尤人。良好的参照体系通常包括分子量Marker(用来确定蛋白条带对应的分子量大小),空白载体对照(如果是诱导表达体系还应该有诱导前的对照),已知量标准产物的正对照;另外还有内参。可是由于经费限制或者偷懒的原因,国内的不少人做Western Blot往往省略参照,导致结果出现问题时无法分析结果――即便有结果也可能影响结果的分析。

内参是最容易被忽略的一项。我们知道,要用Western Blot比较不同条件下或者不同组织中,目的蛋白表达量的相对多少,前提条件是等量的细胞上样,才有比较的基础。特别表达量不高时,上样量的差别就很可能影响结果的分析。所以你需要内参。

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内参即是内部参照(Internal Control),对于哺乳动物细胞表达来说一般是指由管家基因编码表达的蛋白(Housekeeping Proteins),它们在各组织和细胞中的表达相对恒定,在检测蛋白的表达水平变化时常用它来做参照物。在Western Blotting 实验中,除了需要进行蛋白抽提、蛋白定量、等量蛋白上样电泳、转膜、靶蛋白抗体孵育、显色等步骤以外,还需要进行内参的检测,以校正蛋白质定量、上样过程中存在的实验误差,保证实验结果的准确性。

在国外发表的文章中,Western Blotting 实验结果须进行内参校正已成为一种惯例。但是,国内仍有不少科研人员在Western Blotting实验中忽略了内参的使用,将蛋白浓度测定作为规范需相互比较的各种样品间上样量等同的唯一方法。然而各种蛋白质浓度定量方法,都存在局限性,不能完全准确的确定各种样品的准确蛋白浓度。如UV法直接定量,适合测试较纯净、成分相对单一的蛋白质,相对于比色法来说,操作简单,但是容易受到平行物质的干扰,如DNA的干扰;且敏感度低,要求蛋白的浓度较高。比色法测定蛋白浓度一般有BCA,Bradford,Lowry 等几种方法。BCA法与Lowry法都容易受到蛋白质之间以及去污剂的干扰。Bradford 法敏感度最高,且与一系列干扰Lowry,BCA 反应的还原剂(如DTT,巯基乙醇)相容。但是对于去污剂依然是敏感的,其最主要的缺点是不同的标准品会导致同一样品的结果差异较大,无可比性。另外,蛋白质定量以后进行电泳时需要等量上样,此步骤也存在操作误差。在Western blotting实验时使用内参,即可简便地对定量和上样步骤产生的误差进行校正。

在Western Blotting中使用内参其实就是在WB过程中的另外用内参对应的抗体检测内参,这样在检测目的产物的同时可以检测内参的表达,由于内参在各组织和细胞中的表达相对恒定,借助检测每个样品内参的量就可以用于校正上样误差,这样半定量的结果才更为可信。此外使用内参可以作为空白对照,检测蛋白转膜情况是否完全、整个Western Blot显色或者发光体系是否正常。

实验结果分析其实很简单:如果样品蛋白量有限,只够进行一次电泳转膜实验时,分别检测样品的内参量和目的蛋白量。将各样品目的蛋白量分别除以其内参含量,得到的数值即为内参校正后的各样品中目的蛋白相对含量,再用此数值进行样品间的比较和分析,得到目的蛋白含量在不同样品间的实际变化结果。如果样品量充分,可以先检测内参,观测样品间内参显色条带是否一致,根据差异大小调整各样品的上样量重新进行Western Blotting实验,至内参量一致为止;若内参一致,即可进行不同样品间目的蛋白表达变化分析。这样虽然麻烦一点,但是可以保证结果更有说服力,更可信。毕竟我们的实验是一种严谨的工作。

常用的蛋白质内参有GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)和细胞骨架蛋白beta-actin或beta-tubulin。最近的国外文献报道中使用GAPDH内参的较多。上海工程有限公司与国外实验室合作开发的GAPDH,100μl一支,浓度为100μg/100μl,稀释比达1:10000以上,至少可做100次Western mini-blots,价格仅为988元人民币,并且只需4℃保存运输,有效期长达两年。这一产品大大降低了内参的费用,性能稳定、质量可靠、易于保存。

在Western Blotting实验过程中,由于使用的二级抗体往往会与总蛋白中本身含有的某些免疫球蛋白产生反应产生较强信号的杂带。因此,上海工程有限公司推出了HRP标记的GAPDH,在任何情况下使用它都能够得到单一的条带结果,使得内参的使用方法更为简便准确。这种操作省时,无需二级抗体反应的HRP标记的GAPDH内参不仅具备普通GAPDH的所有优点而且结果条带单一,可避免二级抗体的非特异性反应。售价为1498元人民币100μl,稀释比达1:10000以上,至少可做100次Western mini-blots。(Tips:现在读者在购买前面那个便宜的内参时提及就可以额外获赠这个标记内参的10次使用装)

图示: A-G分别表示不同实验小鼠心脏蛋白(上样量50ug),兔抗小鼠Akt抗体(Cat#KC-5A01)检测心脏组织匀浆中Akt水平。加入兔二抗(Cat#KC-RB-035,稀释比例为1:5,000)时同时加入HRP标记的抗GAPDH单抗(稀释比例为1:10,000,Cat#KC-5G5)。采用化学发光试剂盒(Cat#KC-420)及X胶片曝光显影。一次反应即可同时检测目的蛋白(Akt)与内参GAPDH的含量。

目前,市场上供应的其他内参则均需要-20℃保存,干冰运输:Sigma公司的Anti-β-Actin, 价格为241美元200μl,可做100次左右的Western mini-blots。Labvision的β-Actin 399美元1ml, 可做50到100次Western mini-blots; 209美元0.5ml,可做25到50次Western mini-blots。Cell Signaling Technology的BETA-ACTIN ANTIBODY 只可做10次 Western mini-blots,美金价为150美元,人民币售价为1875元。

附:在Western Blotting实验过程中使用内参的方法有:

一、 超级简便的标记内参使用法:只要在二抗孵育时加入HRP标记内参抗体,按照正常操作即可。

二、普通内参:当目的蛋白的分子量大小与选用的内参蛋白分子量相差不大时,可以先进行目的蛋白的抗体温育显色和检测。然后使用Strip缓冲液洗掉膜上的抗体,重新进行内参蛋白的抗体温育、显色检测。

三、当目的蛋白的分子量大小与选用的内参蛋白分子量大小相差比较明显情况下,可以在转膜后预染,根据蛋白质Marker的大小将膜剪为大分子量和小分子量两部分,使内参蛋白与目的蛋白分开。然后两块膜分别与内参蛋白抗体以及目的蛋白抗体进行温育,二抗温育以及显色。

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