质粒提取纯化试剂盒的使用方法

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所属分类:蛋白质组学
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本文总结了金普泰质粒 提取纯化试剂盒的使用步骤,可以根据提取的规模和质量要求选择适合实验的的纯化试剂盒

金普泰生物柱离心式去内毒素超纯质粒 小量抽提试剂盒说明书: wash A ,wash B和wash C: 用前按照试剂 瓶上标明的量分别加入分析纯异丙纯或95%的分析纯乙醇,充分混匀,用后盖紧盖子。

用1ml ddH2O (灭菌)完全溶解RNA酶,将RNA酶放入水中煮,水沸后再煮沸20分钟,关掉火,缓慢冷至室温后,将RNA酶取出,全部加入solution I,充分混匀后,将solution I放入4℃保存.

使用本试剂盒可从1—10ml过夜培养菌液中抽提10—40ug超纯度质粒(OD260/OD280≈1.8)。所得到质粒DNA可直接用于转染 、测序、酶切、克隆等分子生物学操作。无需酚抽提、乙醇沉淀、CsCl离心。

实验步骤:

将菌液倒入1.5ml eppendorf 管,5000 r m p离心5分钟,弃上清液,倒转管子在吸水纸上砸几下,将残余液体去除。votex,加入250ul solution I, votex充分混匀。

加入250ul solution II,缓慢颠倒4次混匀,室温放置5分钟。(注意:solution II天冷时会沉淀,若发现溶液变得混浊,37℃溶化后再用)

加入350ul solution IIIB,立即缓慢颠倒4次混匀,室温放置5分钟。

13000 r m p离心10分钟。

小心将上清750ul吸入到一新的1.5ml eppendorf 管(注意:不要将白色沉淀吸到1.5ml eppendorf 管中。若发现有白色沉淀吸到1.5ml eppendorf 管中,将1.5ml eppendorf 管中的液体重新13000 r m p离心10分钟,将上请液重新吸入一新的1.5ml eppendorf 管中。)。

加入75ul(1/10体积)solution IV, 缓慢颠倒3次混匀。放入4℃ 30分钟,中间缓慢颠倒混匀2次。

13000 r m p离心10分钟。

将结合柱放入2 ml离心管,小心吸750ul上清液于吸附柱中(沉淀很小,注意不要吸到沉淀),室温静置2分钟。

13000 r m p离心1分钟,取出结合柱,弃2ml离心管中的废液,将结合柱再装入2 ml离心管。

加入500ul wash A(用前加入分析纯异丙醇,充分混匀,用后盖紧盖子)于结合柱中,室温放置3分钟。13000 r m p离心1分钟。弃2 ml离心管中的废液。

将结合柱再装入2 ml离心管中,加入650ul wash B(用前加入95%的分析纯乙醇,充分混匀,用后盖紧盖子)于结合柱中,13000 r m p离心1分钟。弃2 ml离心管中的废液。

将结合柱再装入2 ml离心管中,加入500ul wash C(用前加入95%的分析纯乙醇,充分混匀,用后盖紧盖子)于结合柱中,13000 r m p离心1分钟。

倒掉2 ml离心管中的废液,将结合柱装入2 ml离心管,13000 r m p离心2分钟。

将结合柱装入一新的1.5ml eppendorf 管中(由于各厂家1.5ml eppendorf管的口径不一致,管盖可能与结合柱的口径不匹配),室温放置数分钟以确保乙醇挥发干净。在膜中央小心加入50ul TE。不要戳破膜。室温放置2分钟。

13000 r m p离心1分钟,1.5m离心管中即为抽提的去内毒素质粒DNA。

注意事项:

1.提高洗脱液的温度(65℃左右)或将结合柱于室温或37℃水浴静置1分钟以上,可提高DNA的得率。

2.不要在结合柱上做标记,以免乙醇将字迹褪掉。

3.所有试剂用后盖紧盖子.

4. solution II天冷时会沉淀,若发现溶液变得混浊,37℃溶化后再用。

5.本试剂盒通常情况下采用1-1.5 ml过夜培养的菌体进行质粒抽提。若所培养的菌体浓度较低或质粒在宿主菌中的拷贝数较低,可适当增加起始菌体的量至5-10 ml,同时Solution I、Solution II、solution IIIB的用量相应扩大,但要确定比例关系为5:5:7,其他试剂用量不变。

6.起始菌体过量可能会导致抽提的质粒质量不好,如质粒的得率较低,存在RNA或蛋白污染等问题。下列现象可提示菌体过量:

加入Solution II混匀并静置5 min,溶液没有变成透明;或溶液虽然已变透明,但颠倒离心管时发现溶液很粘稠或不均匀。

加入Solution IIIB后,有大块物生成,离心时很难将其离到管底。

7.本试剂盒中,所用吸附柱最大容量为700μl,对双链DNA的最适吸附量为20μg。若经过Solution I、Solution II、Solution IIIB处理并离心后的上清体积超过700μl,可对同一吸附柱分批上样多次。

8.操作步骤2、3、4中,加入Solution II、IIIB之后,应尽量小心温和混匀样品;若混和剧烈可能会导致最后抽提出的质粒超螺旋解开或双链发生断裂。

可以根据质粒提取的量来选择质粒提取纯化试剂盒,例如大中小级别的;此外也可以根据提取质粒的使用用途来选择,转染级别,测序级等纯化试剂盒。生物帮推荐质粒纯化产品大全:凝胶纯化试剂盒 ,磁性的质粒纯化试剂盒 ,微孔板质粒纯化试剂盒 ,质粒纯化试剂盒(Mega) ,酵母质粒纯化试剂盒 。

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