测定核酸的方法

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所属分类:蛋白质组学

 

琼脂糖凝胶电泳法
琼脂糖凝胶具有较大的孔径,因而适用于对较大分子的电泳分离,目前琼脂糖电泳凝胶法已成为核糖核酸和脱氧核糖核酸检测、分离和性质研究的标准手段。
核酸在琼脂糖凝胶中的电泳迁移率取决于琼脂糖浓度、核酸分子的大小以及核酸分子的形状三个因素。一般来说,较低浓度的琼脂糖凝胶适合于较大分子物质的电泳分离,其电泳速度与分子量大小有关,且分子量的对数值与电泳迁移率之间存在着线性关系,由此可以作为定量的基础。其操作方法如下:
1 仪器装置
电泳室及直流电源。常用的水平式电泳室即可,电源为稳压直流电源,常压电泳一般在100-500V,高压电泳一般在500-10000V。
2 试剂
(1) 醋酸-锂盐缓冲液(pH3.0) 取冰醋酸50ml,加水800ml混合后,用氢氧化锂调节到pH值至3.0,在加水至1000ml。
(2) 甲苯胺蓝溶液 去甲苯胺蓝0.1g,加水100ml使溶解。
3 操作法
(1) 制胶 取琼脂糖约0.2g,加水10ml,置水浴中使溶胀完全,加温热的醋酸-锂盐缓冲溶液(pH3.0)10ml,混匀,趁热将胶液涂布于大小适宜(2.5cm×7.5cm或4cm×9cm)的玻板上,厚度约3mm,静置,待凝胶结成无气泡的均匀薄层,即得。
(2) 标准品溶液及供试品溶液的制备 按照各药品项下制备。
(3) 点样与电泳 在电泳槽内加入醋酸-锂盐缓冲溶液(pH3.0),将凝胶板置于电泳槽架上,经滤纸桥浸入缓冲液。于凝胶板负极端分别点样1μl,立即接通电源,在电压梯度约30V/cm、电流强度1-2mA/cm的条件下,电泳约20min,关闭电源。
(4) 染色与脱色 取下凝胶板,用甲苯胺蓝溶液染色,用水洗去多余的染色液至背景无色为止。
在凝胶电泳中,首先应用的是琼脂电泳,它具有以下优点。1琼脂含液体量大,可达98%-99%,近似自由电泳,但是样品扩散度比自由电泳小,对蛋白质吸附极微。2琼脂作为支持体有均匀,区带整齐,分辨率高,重复性好等优点。3电泳速率快。4透明而不吸收紫外线,可以直接用紫外检测仪做定量测定。5区带易染色,样品易回收,有利于制备。然而琼脂中有很多硫酸根,电渗作用大。琼脂糖是从琼脂中提取出来的,是有半乳糖和3,6-脱水-L-半乳糖相互结合的链状多糖。含硫酸根比琼脂少,因而分离效果明显提高。

 

 

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