血清脂蛋白琼脂糖凝胶电泳的原理与操作步骤

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所属分类:蛋白质组学
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血清脂蛋白琼脂凝胶电泳 主要涉及两个过程:一、血清脂蛋白的预染;二、预染的血清脂蛋白电泳分离。本文总结了血清脂蛋白琼脂凝胶电泳 、试剂与器材以及操作步骤。

原理:

将血清脂蛋白用脂类染料(如苏丹黑或油红O等)进行预染.再将预染过的血清置于琼脂糖凝胶板上进行电泳分离.通电后,脂蛋白向正极移动,并分离为几个区带.

试剂与器材:

1、巴比缓冲液(pH8.6,离子强度0.075):为电极缓冲液

巴比妥钠15.4g,巴比妥2.76g,EDTA 酸0.292g,加水溶解后加水至1000ml

2、三羟甲基氨基甲烷缓冲液(pH8.6)为凝胶缓冲液

三甲基氨基甲烷1.212g,EDTA酸0.29g,NaCl 15.85g加水溶解后加水至1000ml

3、琼脂糖凝胶

琼脂糖0.45g,三痉甲基氨基甲烷缓冲液50ml,水50ml

加热至沸,待琼脂糖溶解后立即停止加热.

4、挖槽工具制作

切口刀:刀口长15mm的刀片,中央夹一有机玻璃或木片,用螺丝固定,使两刀片相距1.5mm.挖槽小匙:用直径1.5mm的铜丝约6cm长,一端锤成扁平,用砂纸磨光.

5、电泳槽电泳仪 :同血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳的仪器.

操作:

1、预染血清:血清0.2ml加苏丹黑染色液0.2ml于小试管中,混合后置37℃水浴染色30分钟,然后离心(2000转/分,约5分钟).

2、制备琼脂糖凝胶板:将已配制的0.45%琼脂糖凝胶于沸水浴中加热融化,用吸管吸取凝胶溶液浇注载玻片,每片2.5ml,静置约半小时后凝固(天热时需延长,可放冰箱数分钟加速凝固).

3、点加血清:已凝固的琼脂糖凝胶板的一端约2cm处,用切口刀片垂直切入凝胶后立即取出,然后用铜丝小匙将长方小条凝胶取出.以小片滤纸吸干小槽中水分,用血色素吸管吸取经过预染的血清约15μl,注入凝胶板上的小槽内.

4、电泳:将加过血清的凝胶板平行放入电泳槽中,样品应在阴极一端.两块三层纱布于巴比妥缓冲液中浸润,然后轻轻紧密贴在凝胶板两端,纱布的另一端浸于电泳槽内的巴比妥缓冲液(注意:此电极缓冲液不能用三羟甲烷缓冲液代替).接通电源,电压为120~130V,每片电流为3~4mA.约经电泳15至55分钟,即可见分离之色带.

结果及临床意义

1、正常人血清脂蛋白可出现三条区带,从负极到正极依次为β-脂蛋白(最深)、前β-脂蛋白(最浅)、α-脂蛋白(比前β-脂蛋白略深些),在原点处应无乳糜微粒.

2、如果前β-脂蛋白比α-脂蛋白深,结合血清甘油三酯明显升高和胆固醇正常或略高,可以定为Ⅳ型高脂蛋白血症.

3、如果β-脂蛋白区带比正常血清明显深染者,同时结合血清总胆固醇明显增高、甘油三酯正常者为Ⅱa型;若结合血清总胆固醇增高而甘油三酯略高的前β略溶者为Ⅱb型.

4、结果β-和前β-两区带分离不开连在一起称“宽β区带”,结合血清甘油三酯和胆固醇均有所增高,可定为Ⅲ型.

5、如果原点出现乳糜微粒,β,前β均正常或减低,结合血清甘油三酯明显升高,可定为Ⅰ型.

注意事项:

1、电泳样品要求为新鲜的空腹血清.

2、每一块凝胶上可平行挖两条小槽,因而可加两个样品.

3、如果用一形状大小和小槽一样的有机玻璃片,在琼脂糖胶凝固前固定于适当位子上,当凝固后取出有机玻璃片,凝胶板上留下小槽可直接加样,不需挖槽.

4、个别实验中如果需要保留电泳实验的样本,可以在电泳实验结束后,将凝胶板(连同玻片)放置在清水中浸泡脱盐2小时,接着把凝胶板放置在烘箱(80℃左右)烘干即可.

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