iTRAQ技术问题答疑

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所属分类:蛋白质组学

1. itraq的原理是什么?

Itraq的检测可以做这样的比喻,蛋白被打成肽段后,被平均的铺在了一个有384个孔的平板上,然后机器会从每个孔中选取浓度在前5名的蛋白进行鉴定和比对,所以,如果假设每个一个样本中有100个蛋白,他们的浓度均为1%,那么得到的结果就是蛋白的得分低,但是鉴定的蛋白数量会很多,可以达到90以上;

如果一个样本中有100个蛋白,有3个蛋白的含量分别为30、20、10、其他的97钟蛋白为剩下的50%,那么这三种蛋白的得分高,但是鉴定出的蛋白数量会比较少,也许只有50或者60个。因为一些高丰度的蛋白会大量分部在上述的小孔中,抑制了其他蛋白的检出效果。

2. iTRAQ技术区别与以往二维电泳技术,具有如下优势:

2.1灵敏度很高,检测限较低,可检测出低丰度蛋白;

2.2高通量:同时对4-8个样本进行分析,提高实验通量,可同时对多个时间点或不同处理的蛋白质进行分析;

2.3分离能力强,分析范围广,iTRAQ可以对任何类型的蛋白质进行分离鉴定,包括高分子量蛋白质、酸性蛋白和碱性蛋白,膜蛋白和不溶性蛋白;

2.4结果可靠:通过高度敏感性和精确性的串联质谱方法,不需要凝胶,即可获得相对定性与定量分析结果;

2.5自动化程度高:液相与质谱连用,自动化操作,分析速度快,分离效果好。

由此可得,iTRAQ技术比二维电泳技术能发现更多数量和种类的蛋白,但在比较胞浆蛋白及蛋白量的变化方面,二维电泳技术有一定长处,对iTRAQ的实验结果有互补作用。

3. LC/MS中蛋白处理是定量还是定性?

这是属于定量,需在蛋白定量后,各取相同量(50-100 ug)的蛋白(体积不大于25 ul,少于25 ul的用专用裂解液补至25 ul)进行还原化和烷基化。

4. LC/MS对需要检测的蛋白有量的要求吗?

有的,要求蛋白量最低50 ug,浓度最低要为5 ug/uL,否则同位素无法标记。

5. 数据分析中主要看哪些参数?

对于液质联用的数据分析,一般观察的参数为:Total Ion Score C.I. %(可信度)和Tag-80/Tag-0(两样本的比值)。

6. 众多可信度数值中,主要选择哪些进行研究?

一般来说可信度在80%以上的均为可信程度非常高的。有些蛋白可信度在60%以上的也可以作为参考数据。

7. 可信程度低于80%的数据有意义吗?

可信程度低于此值的,如果有感兴趣的蛋白可以通过ELISA、WB、Q-PCR、液态芯片等技术手段进一步验证,毕竟LC/MS是研究蛋白组学的方法之一,如全面研究还是要综合各种研究方法。

8. 两样本的比值都代表什么?

两样本的比值如果在0.9-1.1之间的,可以认为两样本的含量是一样的,即比值为1:1;而小于0.9或大于1.1均可认为两样本之间的比值是有差异的。

9. 质谱图中显示的是各种蛋白吗?

不是各种蛋白而是蛋白被打碎后的离子图谱,由于质谱法是电场和磁场将运动的离子(带电荷的原子、分子或分子碎片)按它们的质荷比分离后进行检测的方法。测出的是离子的准确质量,由此来确定离子的化合物组成。

10. 液质联用是不是可以检测所有蛋白?

原则上讲是这样的,如果单个蛋白在所提供的样本中的含量少于100 ng可能就检测不出来了,总体上样量为50-100 ug,一般每次可以检测出来的蛋白数量从几百到几千都有可能,取决于标本本身的情况。

11. 提供的结果除了分析数据外,是不是包括蛋白名称还是蛋白的大致归类?

给出的是蛋白的名称,按照可信度从大到小排列。

12. 是否还有每个蛋白的鉴定图谱或者提供蛋白结果分析?

没有每个蛋白的鉴定图谱,图谱是肽段。

13. 蛋白上样量是多少?收集蛋白体积100 ul吗?应该大于100 ul还是小于100 ul?

itraq对蛋白收集体积没有特别要求,只要求浓度至少是5 ug/ul的蛋白至少20 ul即可。

14. 差异蛋白试验的结果包括哪些呢?存在差异的蛋白种类,名称,肽段序列,分子量,pI或者有否其他的什么信息,结果是以什么形式进行报考呢?表格或图片?

差异蛋白试验的结果包括:Protein Name、Species、Accession Number、Protein MW、Protein PI、Total Ion Score、L/N;结果以表格形式提供。

15. 对实验的样品有什么要求?浓度,纯度,是否可以有盐,如果是胞内蛋白需要怎样裂解,或者你们是否可以帮忙处理样品?

若蛋白由您提供给我们,则蛋白浓度要求5 ug/ul,体积要求至少50 ul,总蛋白量至少100 ug;或者您直接提供组织、细胞或菌体给我们,蛋白由我们来抽提,但是您要告知我们蛋白是抽提全蛋白还是膜蛋白还是其他特殊蛋白。

16. 检测的蛋白是酶,酶分型较多,是否可将每种酶分型都检测出来?

检测itraq有一个蛋白库,这个库是网上最新公布的世界上研究出来的所有蛋白信息,如果您检测的酶的各种分型此库里都有收录,那么就可以检测出来,如果没有就检测不出来,这个要看世界上对该种酶研究的程度。

17. 是否可以提供蛋白序列?

由于检测出的蛋白数量很多,都是成百上千个,itraq机器不可能将检测出的每种蛋白序列都提供给您,这个工作量非常大,而且也不是每一个检测出来的蛋白对您都有意义,一般可以先提供结果,您选择研究有意义的蛋白名称,我们可以提供相应蛋白肽段给您。

18. 若使用itaq检测human血清,需要血清量是多少?

若itraq方法检测血清,则检测前需要对血清进行高峰度蛋白去除,收集低丰度蛋白后进行itraq检测,去除高峰度蛋白方法是使用相应提纯柱子,此柱子很昂贵。

19. Itraq检测是否需要重复以便使结果具有统计学意义?

不需要,Itraq技术本身的算法,可以认为得到的蛋白之间的比例,并且是可信度高的实验结果是具有统计学意义的,并且在这个基础上可以进行后续的验证。

20. 目前开展该项业务的公司有很多,能否推荐下哪家公司做的比较好?

目前能开展itraq的公司挺多的,个人推荐上海舜百生物做的相对还是不错的。之前是叫舜田,现在据说服务质量挺好,周期大约1个月左右。

21. 如果打算开展该项试验,需要提供什么样的样品形式?

最好是提供抽提好的蛋白,冻成干粉,然后用干冰快递过来。组织蛋白抽提不能用含二维电泳的变性剂来裂解蛋白。如果组织的话,存放到-80度冰箱中,然后用干冰快递过来,上海本地的,也可以将组织用冻存管装好,投入液氮中运过来即可。

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