琼脂糖电泳步骤琼脂糖电泳步骤

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琼脂糖电泳步骤之超级基础篇----对论坛的一些帖子和个人的看法做个汇总,欢迎大家多多指正。

一、电泳前准备

准备内容
作用

1.刷干净电泳制胶的梳子,板子,槽子,蒸馏水洗净晾干
防止不必要的重复污染,减少外来的污染。梳子干净有利于梳孔的形成。

2.检查电泳槽,根据情况更换buffer
排除电泳槽的电极接触不良,确保buffer的缓冲能力,减少污染。

3.根据DNA的分离范围选择合适的胶浓度并记录
达到较好的分离效果,防止样过快跑出胶或者是过慢浪费时间。

4.计算agarose的用量和制胶 buffer的用量记录,胶最终越薄越好。

实验记录备查

二、制胶

步骤
注意事项

1.称量agarose和buffer

Buffer不要用成H2O,称量相对准确

2.融胶,加热到胶产生大量的气泡时,拿出摇匀,继续加热到完全溶解,拿出摇匀,再加热到沸腾。

非常热,小心烫手,另外注意不要加热过度使胶冲出瓶子。因此注意选择起码为胶体积2倍以上的瓶子。保证胶混匀和完全溶解,减少可能因此引起的胶中孔径不均匀影响分离效果。

3.倒胶,可用水浴的办法使胶冷却到60度左右,即手可以握住瓶子的温度,沿着制胶板的一侧,缓缓地一次性倒入。梳子最好是预先放好并固定的,注意梳孔的体积能点的下所有的样。用枪头赶掉气泡。

制胶的桌面相对水平。倒胶时尽量减少气泡的产生。EB如果在制胶时加入,在60度左右时加入,使终浓度为0.5ug/ml。不宜过低,染色成像不明显;不宜过高,导致背景太深。摇匀要沿着瓶壁摇动,尽量减少气泡产生的可能性。高浓度胶例如2%以上的EB很难摇匀,而且凝的速度也相对快,强烈建议跑完胶之后再用EB染色。

4.室温凝胶30分钟

过程中不要碰到梳子,尽量保持胶的位置不移动。时间不宜过久,导致胶干燥变形;不宜过短,影响胶内部孔径形成。

5.拔梳子,放入电泳槽。

缓缓地将梳子垂直从梳孔拔出,尽可能使梳子是同时从各个胶孔拔出的。暂时不用的胶最好放入电泳槽电泳液中浸泡。电泳液要浸没胶1mm。

三、上样电泳

步骤

注意事项

1.样品中加入loading buffer使其终浓度为1 X,混匀

Loading buffer浓度不宜过低,点样时样品不能很好的沉在胶孔里;不宜过高,电泳时容易形成带形的变形。注意混匀。

2.点样

沿着胶孔的边缘匀速加入。尽量避免碰坏胶孔。枪头不要吸过多的气泡,拔起时不要过猛带出样品。每点一个样完,吸取buffer洗枪头,避免样品混杂。如果是有特殊要求,例如回收,强烈建议每点一个样换一次枪头。

加样的速度当然是越快越好,注意保证质量。点样的量不要太大,一方面是体积不要太大,溢出污染邻位样品;一方面两不要太大,容易导致脱尾和模糊不清。

3.接通电源,选择合适的电压和时间电泳。

胶孔与电极成水平状态,防止样品跑歪。跑胶期间不时回来看看,防止样品跑出胶等意外发生。

四、染色成像

步骤

注意事项

1.染色
如果胶中没有加入EB,用0.5ug/ml的EB溶液浸染30分钟。

2.调整镜头的拍摄范围和焦距,成像

3.打印照片做分析记录

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