DNA印迹(Southern Blot )

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所属分类:蛋白质组学

【实验目的】

掌握DNA印迹技术的基本原理, 学习DNA印迹技术的操作方法,了解DNA印迹技术的应用范围。

【实验原理】

DNA印迹是1975年由英国Southern创建的。

其基本原理是:DNA分子经限制性核酸内切酶酶切后,由琼脂糖凝胶电泳将所得DNA片段按分子质量大小分离,然后将DNA片段变性,并使凝胶中的单链DNA片段转移到尼龙膜、硝酸纤维素膜(NC)或其他固相支持物上,此法中DNA片段由液流携带通过虹吸作用由下向上抽吸,从凝胶转移印至滤膜表面。

然后与相对应结构的已标记的探针进行杂交反应,用放射性自显影或酶反应显色来鉴定待测DNA分子。

DNA印迹技术主要用于对基因组DNA的定性和定量分析、克隆基因的酶切图谱分析、基因突变分析及限制性片段长度多态性(RFLP)等。

【实验对象】

待测DNA。

【试剂与器材】

(1) 水平电泳装置,电泳仪,紫外灯,摇床。

(2) 待测DNA,琼脂糖,溴化乙啶,DNA探针,保鲜膜,缓冲液。

(3) 0.25 mol/L HCl

(4) 变性液:1.5 mol/L NaCl; 0.5 mol/L NaOH (保存于室温)。

(5) 中和液: (pH 7.0) 5 mol/L NaCl; 0.5 mol/L Tris-HCI (保存于室温)。

(6) 转移液 (20×SSC pH 7.0):用800 ml H2O溶解175.3 g NaCl和88.2 g柠檬酸钠,以浓 HCI调pH至7.0,用双蒸水定容至1 L。分装后高压灭菌。

(7) 2×SSC。

(8) 尼龙膜或硝酸纤维素 (NC) 膜。

【实验方法与步骤】

(1) 取适量已酶切充分的待测DNA (1 μg左右) ,于0.8%~1.25%的琼脂糖凝胶上与合适的 DNA分子量标准一同进行稳压电泳。

(2) 切去凝胶一角以标记方向,用溴化乙啶染色后拍照记录电泳结果 (拍照时,凝胶旁放一尺子,便于以后对照电泳带在膜上的位置) ,再切下一侧DNA分子量标准带。

(3) 处理凝胶以备转膜。

1) 蒸馏水短暂漂洗凝胶(轻摇)。

2) 将凝胶浸没入10倍于凝胶体积(约30min)的0.25mol/L HCl溶液中15~30min,使DNA脱嘌呤。蒸馏水短暂漂洗凝胶2次。

3) 将凝胶浸没入10倍体积的变性液中20min,2次,蒸馏水漂洗2次。

4) 将凝胶浸没入10倍体积的中和液中20 min,2次,使变性液被中和。

(4) 在制备杂交用胶时准备转移的平台、膜、滤纸等。

(5) 安装虹吸转移装置:如图25-3所示,将一固体支持物置于盛有足以浸没其一半高度的20× SSC的平皿中,依次将1张Whatman 3 mm滤纸桥,3张Whatman 3 mm 滤纸,凝胶,叠放于固体支持物上,用塑料薄膜包裹凝胶边缘后。

将1张在蒸馏水中平衡过的尼龙膜(或用蒸馏水浸湿,然后在20×SSC中平衡10min的NC膜),5张Whatman 3mm滤纸及一叠4cm纸巾塔依次置于凝胶的上部,再放一玻璃板,其上压重物(注意:凝胶与转印膜间应避免有气泡,滤纸、吸水纸巾等必须大小一致)。转移持续4 h以上或过夜,勿使转移液干枯。

(6) 使已转移的DNA与膜交联:取出转印膜,用铅笔在膜上标记样品孔的位置,并切去一角以标示方向。用2×SSC漂洗转印膜,然后将其放在一张Whatman 3mm滤纸上,有DNA的一面朝上,使其完全干燥。再将膜置于UV crosslinker中,在紫外光下自动交联或将NC转印膜置于可透过紫外线的塑料夹层中,带有DNA的一面朝下,置于紫外透射仪(波长在254 nm)上,以合适的照射强度进行紫外线交联,以固定DNA。

(7) 用蒸馏水短暂的漂洗已交联的膜后,将其夹于2张Whatman 3 mm滤纸之间,80℃真空干烤2h或空气干燥。转印膜干燥后可夹在2张Whatman 3mm滤纸之间,室温下放置数月。备做核酸杂交实验。

Southern Blot仅仅是将待测DNA片段从电泳凝胶中转移并固定到固相支持物上,要实现DNA探测还需完成核酸杂交实验(包括探针标记、杂交和检测三个后续实验步骤)。杂交的双方是待测核酸序列和探针,二者按碱基互补原则退火形成双链。

探针是用于检测的已知核酸片段,根据标记物的不同可分为放射性(同位素)标记探针和非放射性(非同位素)标记探针。放射性标记的探针,是在探针制备过程中掺入32P-dNTP而实现放射性标记的。非同位素标记物有生物素(biotin)、地高辛(dig-oxigenin,Dig)和荧光素(Fluorescein)等。待测核酸与探针杂交后,通过放射自显影、化学显色或直接在(荧光)显微镜下观察杂交信号来鉴定待测核酸分子的大小及含量(方法见第六节后附录一和附录二)。

【注意事项】

(1) 在分辨核酸电泳带所需的凝胶浓度范围内,电泳中使用的琼脂糖凝胶的浓度越低越好,并且厚度应 ≤ 7mm。转印前切去凝胶多余的边缘,因为凝胶边缘多比凝胶本身要厚,与滤膜很难紧密相贴。

(2) 电泳结束后,应在紫外检测仪下仔细观察酶切是否完全、电泳分离效果是否良好、DNA样品有无降解、样品量是否一致、是否有因电场强度不均匀导致样品带泳动速度不一致等。

(3) 戴手套以防手受酸碱溶液损伤,同时避免污染滤膜。取拿滤膜时使用平头镊子。

(4) 在转移过程中,如吸水纸巾全部润湿需及时更换,否则会造成缓冲液的逆流。

(5) DNA片段的大小决定其转移速度。小于1kb的DNA片段,1h即可完成转移过程。大片段 DNA的转移速度和效率则慢得多,如大于15kb的DNA片段需要18h以上。因此,当DNA片段长度大于15kb时需进行脱嘌呤(稀盐酸)及强碱水解处理,使之降解成较小的片段,从而提高转移效率。

 思 考 题

1. Southern Blot技术的基本原理是什么?

2. 影响DNA印迹效果的主要因素有哪些?

3. Southern印迹技术的应用范围有哪些?

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