琼脂糖凝胶电泳常见问题与解决办法

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所属分类:蛋白质组学

一、凝胶制备

1. 微波炉溶解琼脂糖时,胶液沸腾冲溢出三角锥瓶微波炉加热时胶液可能发生剧烈沸腾,

(1)总液体量不宜超过三角锥瓶的50%容量。

(2)2%以上胶液设置中火加热。

(3)胶液剧烈沸腾时,停止加热,移开三角锥瓶,请戴上防热手套,小心摇动三角锥瓶,然后再次加热,胶液沸腾直至胶液清澈,保证琼脂糖完全溶解。

2. 琼脂糖电泳图像背景模糊不清:琼脂糖没有完全溶解会造成电泳图像背景模糊不清。完全溶解的琼脂糖胶液清澈,三角锥瓶内壁应没有粘附琼脂糖颗粒。

3.加热后水分蒸发,如需要应加入热的蒸馏水,补足到原来的重量,摇匀。

二、电泳

1. DNA条带模糊,拖尾。

(1)DNA降解。避免核酸酶污染。

(2)DNA上样量过多。减少凝胶中DNA上样量。

(3)电泳缓冲液陈旧:电泳缓冲液多次使用后,离子强度降低,pH值上升,缓冲能力减弱,从而影响电泳效果。建议经常更换电泳缓冲液。

(4)电泳条件不合适。电泳时电压不应超过20 V/cm,温度<30℃,巨大DNA链,温度应<15℃,核查所用电泳缓冲液是否有足够的缓冲能力。

(5)DNA样含盐过高。泳前通过乙醇沉淀去除过多的盐。

(6)有蛋白污染。电泳前抽提去除蛋白。

(7)DNA变性。电泳前勿加热,用20 mM NaCl缓冲液稀释DNA。

2. DNA条带淡弱或无DNA带。

(1)DNA的上样量不够:增加DNA的上样量。

(2)DNA降解:避免DNA的核酸酶污染。

(3)DNA走出凝胶:缩短电泳时间,降低电压,增强凝胶浓度。

(4)分子大小相近的DNA带不易分辨。增加电泳时间,使用正确的凝胶浓度。

(5)DNA变性:电泳前请勿高温加热DNA链,用20 mM NaCl Buffer稀释DNA。

(6)DNA链巨大,常规凝胶电泳不合适。在脉冲凝胶电泳上分析。

3. DNAMARKER条带扭曲。

(1)配制凝胶的缓冲液和电泳缓冲液不是同时配制的。使用同时配制的缓冲液。电泳时缓冲液高过液面1~2 mm即可。

(2)电泳时电压过高。可以在电泳前15分钟用较低电压(3 V/cm),等条带出孔后,再调电压。

(3)尽量慢慢加样,等样品自然沉降后再加电压。

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