PRM相对定量技术

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平行反应监测( Parallel Reaction Monitor-ing, PRM)是一种基于高分辨、高精度质谱的离子监视技术,能够对目标蛋白质、目标肽段(如发生翻译后修饰的肽段)进行选择性检测,从而实现对目标蛋白质/肽段进行绝对定量。PRM技术首先利用四级杆质量分析器(如Orbitrap系列)的选择能力,用Q1选择目标肽段的母离子;随后在collision cell中对母离子进行碎裂;最后利用高分辨、高质量精度分析器在二级质谱中检测所选择的母离子窗口内的所有碎片的信息。可对复杂样本中的目标蛋白质/肽段进行准确地特异性分析。

平行反应监测PRM相对定量技术的优势

相比于传统SRM/MRM只检测目标离子对的模式, 平行反应监测PRM相对定量技术将采集二级信息所用的四级杆质量分析器替换为更高分辨、更高质量精度的分析器,实现了从目标离子对检测到全部目标离子碎片检测的转化。因此,平行反应监测PRM相对定量技术不仅具有SRM/MRM的靶向定量分析能力,还同时具备了定性能力。

1. 质量精度达到ppm级,能够比SRM/MRM更好地排除背景干扰和假阳性,有效提高复杂背景下的检测限和灵敏度;

2. 对子离子进行全扫描,无需选择离子对和优化碎裂能量,更容易进行方法学建立;

3. 更宽的线性范围:增加至5-6个数量级。

关于PRM你需要知道:

1. 预实验可行性分析是必须的。因为靶蛋白通常是用iTRAQ或者TMT等非靶向的定量蛋白组中筛选出来的,而非靶向定量蛋白组分析所用的仪器、步骤和PRM可能有很大差别,因此不是每一个筛选的差异靶蛋白都可以在PRM中鉴定到,需要先做预实验判断一下。

2. 挑选特异性肽段是个技术活,不是随便一条特异性肽段都能用于定量,需要根据肽段的序列和检测到的情况具体判断。

3. 合成同位素标记的重标肽段肽段用于定量比合成普通肽段用于定量准确性要高,当然合成费用也更高。

4. PRM可以做相对定量吗?可以。这样可以省掉合成重标肽段以及标曲建立的步骤,费用可大大降低。

5. 建议至少三个上机重复。平行反应监测PRM相对定量技术这么先进,精度这么高我是不是就不用做上机重复了。其实任何一个实验都是需要重复的,需要来排除误差。例如简单的qPCR精度也很高,也需要做两个甚至三个复孔排除误差。

6. 如果要大规模定量蛋白的话,买抗体也是一笔不小的费用。而平行反应监测PRM相对定量技术方法建立成功后,一次最多可同时检测20个以上不同蛋白。因此使用PRM技术对于多个蛋白的定量是个不错的选择。

7. 一些物种的商业化抗体很少,定制抗体费时费力费钱,效果还不一定好。使用平行反应监测PRM相对定量技术没有物种限制,对于稀缺物种的蛋白定量是一个很好的方法。

8. 平行反应监测PRM相对定量技术作为一种蛋白验证手段已广泛用于生物学研究中,有很多相关的文章已经发表。

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