RNA抽提之应知应会

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所属分类:蛋白质测序

背景介绍
实验前方法/试剂的选择
问题解答 (外源性污染导致的问题不在本解答考虑中)
RNA 抽提的“三大纪律八项注意”
Rnase 污染的10大来源
RNase 和 DEPC 处理
RNA 抽提的10大窍门
提高 RNA 得率
经典抽提小技巧
特殊组织的抽提
样品冻融的影响
RNA 质量的判断
RNAguard:使降解成为历史的试剂
 
背景介绍
 
对大部分实验人员来说,RNA 抽提比基因组 DNA 抽提要困难得多。事实上,现有的 RNA 抽提方法/试剂,如果用于从培养细胞中抽提 RNA,比抽提基因组 DNA 更方便,成功率也更高。那为什么同样的方法用于组织 RNA 的抽提,总会碰到问题呢?
组织 RNA 抽提失败的两大现象是: RNA 降解和组织内杂质的残留。关于降解问题,首先看一下为什么从培养细胞中抽提 RNA 不容易降解。现有的 RNA 抽提试剂,都含有快速抑制 Rnase 的成分。在培养细胞中加入裂解液,简单的混匀,即可使所有的细胞与裂解液充分混匀,细胞被彻底裂解。细胞被裂解后,裂解液中的有效成分立即抑制住细胞内的 Rnase,所以 RNA 得以保持完整。也就是说,培养细胞由于很容易迅速与裂解液充分接触,所以其 RNA 不容易被降解;反过来讲,组织中的 RNA 之所以容易被降解,是因为组织中的细胞不容易迅速与裂解液充分接触所致。因此,假定有一种办法,在抑制 RNA 活性的同时能使组织变成单个细胞,降解问题也就可以彻底解决了。液氮碾磨就是最有效的这样一种办法。但是,液氮碾磨方法非常麻烦,如果碰到样品数比较多的时候更加会有此感觉。这样就产生了退而求其次的方法:匀浆器。匀浆器方法没有考虑细胞与裂解液接触前如何抑制 Rnase 活性这个问题,而是祈祷破碎组织的速度比细胞内的 Rnase 降解 RNA 的速度快。电动匀浆器效果较好,玻璃匀浆器效果较差,但总的来说,匀浆器方法是不能杜绝降解现象的。因此,如果抽提出现降解,原来用电动匀浆器的,改用液氮碾磨;原来用玻璃匀浆器的,改用电动匀浆器或者直接用液氮碾磨,问题几乎 100% 能获得解决。影响后续实验的杂质残留问题,其原因比降解更多样,解决方法响应也不同。总之,如果出现降解现象或者组织内杂质残留现象,则必须对具体实验材料的抽提方法/试剂进行优化。优化大可不必使用您的宝贵样品:可以从市场上购买一些鱼/鸡之类的小动物,取相应部分的材料用于 RNA 抽提,其它部分用于抽提蛋白质 – 用嘴碾磨,肠胃抽提。
究竟怎样才能确保 RNA 抽提的成功率呢?实验前选择合适的方法/试剂,这是最重要的一步;好的方法/试剂在确保成功的同时,操作方便,经济实用。当然,您的选择可能仍然有问题,这就需要能正确分析实验失败的原因,以便改进。
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实验前方法/试剂的选择
 
0:抽提 RNA 的目的
RNA 用于不同的后续实验,其质量要求不尽相同。cDNA 文库构建要求 RNA 完整而无酶反应抑制物残留;Northern 对 RNA 完整性要求较高,对酶反应抑制物残留要求较低;PCR" onclick="tagshow(event)" ="t_tag">RT-PCR 对 RNA 完整性要求不太高,但对酶反应抑制物残留要求严格。投入决定产出;每次都以获得最高纯度的 RNA 为目的,劳民伤财。
 
1:样品的收集/保存 – 影响降解的因素
样品离开活体/或者原来的生长环境后,样品中的内源酶即会开始降解 RNA,降解速度与内源酶含量及温度有关。传统上,只有两个办法可以彻底抑制内源酶活性:立即加入裂解液并且彻底而迅速地匀浆;切成小块后立即投入液氮冷冻。这两个办法都要求操作快速。后者适合所有的样品,而前者只适合细胞及内源酶含量较低的并且较容易匀浆的组织。具体地讲,植物组织,肝脏,胸腺,胰腺,脾脏,脑,脂肪,肌肉组织等最好都先用液氮冷冻起来,再往下做。

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