微板考马斯亮蓝蛋白定量法 ,大家共享!评论一下各位的心得

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所属分类:蛋白质测序

微板考马斯亮蓝蛋白定量法
1. 0.01%考马斯亮蓝液的准备
称取10 mg考马斯亮蓝(coomassie brilliant blue,CBB)G-250溶于5 ml 95%的乙醇中,加入85%的磷酸10ml,混匀,作为储存液保存于4℃。使用时取此母液每1.5 ml用双蒸水稀释至10ml即为工作液,应避光保存,一月内用完。若有不溶沉渣宜滤纸过滤后使用。
2. 制作标准曲线

表1 组织匀浆液蛋白含量测定中标准曲线的制作
试管编号 1 2 3 4 5 6 7
BSA Conc 0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1
(mg/ml)
BSA Vol (μl)5 5 5 5 5 5 5
CBB Vol (μl)400 400 400 400 400 400 400
OD595值 0 0.022 0.039 0.082 0.119 0.159 0.197

将标准牛血清白蛋白(BSA)溶于实验所用的细胞或组织裂解液,配制成10 mg/ml的母液,稀释10倍后成为1mg/ml的二级母液,再用双蒸水分别稀释成0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mg/ml等7个浓度管,按上表操作。在试管中完成反应,随后移入酶标板,每孔200μl,测定波长490或595nm。测定完成后,以标准管的OD值为横坐标,对应的蛋白浓度为纵坐标制成标准曲线。
y = 5.0807x - 0.0057 R2 = 0.9997。(参考)
3. 样本蛋白测定:取待侧样品5μl加入400μl CBB液,其余操作同标准曲线制作,测定OD595值。所得OD值在标准曲线拟合公式上算出相应的蛋白含量。样品中的蛋白含量以mg/ml表示。
注意:
  1. 所用器械不能有蛋白污染,须经泡酸处理、洗洁精浸洗或用新的。
  2. CBB子液与所加标准品和样品的量视情况适当调整,本方案所列出比例及OD值仅供参考。
  3. 若样品为悬浊液,应将样本离心后取上清做蛋白定量以反应总蛋白量;或先将悬浊液碱化为溶液后再行测定(加入5-20%体积的2-5mol/L的NaOH,视情况而定)。
  4. 所有样品宜在2-10min内测完。
  5. 若对上样精度有把握,可以直接在酶标板内先后直接加入适量样本与测定工作液进行反应。
6.本文件取自于别人,贴出来,大家共享也请大家评论一下此法的优劣.

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