蛋白定量FAQS

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所属分类:蛋白质测序

蛋白定量是生物学实验不可缺少的一部分。为验证细胞裂解是否成功,或为了将多个样品进行平行实验比较或标准化保存,需对细胞裂解液进行蛋白定量;

为了判定蛋白的产量,需对纯化好的蛋白进行定量;为了将纯化好的蛋白用生物素或者报告酶进行标记,同样需首先对蛋白样品进行定量,以保证标记反应在适当的化学浓度下进行。

现今有很多商品化的蛋白定量试剂盒,如BCA定量试剂盒等,操作起来,简便快捷。当然也有不少实验室,还是采用传统的方法进行蛋白定量。现将蛋白定量过程中所遇的一些问题小结一下。

Q1: 采用考马斯亮蓝G5-20法进行蛋白定量实验,制作标准曲线及测定样品时,为什么要将各试管中溶液纵向倒转混合?

A1:将各试管中溶液纵向倒转混合目的是使反应充分,并且使整个反应液均一,否则在比色测定时,结果会有较大偏差,使标准曲线的制作不标准,后续的测定结果就不可靠。

Q2: 采用Bradford法进行蛋白定量,样品中一般含哪些物质对此法有干扰,哪些物质对此法干扰很小或没有干扰?

A2: 一般来说,样品中如含有K+ 、Na+ 、Mg2+、tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法;但仍有一些物质干扰此法的测定,主要的干扰物质有:去污剂、Triton X-100、十二烷基硫酸钠(SDS)和0.1N的NaOH。

Q3: 采用考马斯亮蓝蛋白定量法(Bradford法)测定蛋白含量,实验可能遇到的问题、原因及解决办法?

问题:空白吸收好,但是标准品和样品数值比预期小

原因:

1.试剂储存不当;解决:试剂应冷藏

2.试剂冷;解决:室温温育

3.错误波长;解决:595nm测量

问题:空白和标准品吸收好,但是样品数值比预期小

原因:蛋白质分子量小于3000;解决:用BCA法

问题:有沉淀形成

原因:1.样品中有去污剂;解决:透析或稀释样品

2.样品没有充分混合,反应时间太长;解决:立即混合,测量

问题:所有反应颜色深

原因:1.强碱性条件;解决:透析或稀释样品

2.样品体积太大,导致PH升高;解决:去除干扰物质

问题:需要在不同波长测量

原因:没有相应595nm滤光片;解决:可以在575-615nm之间测量,但是灵敏度会降低

Q4: 采用BCA蛋白定量法测定蛋白含量时,实验可能遇到的问题、原因及解决办法?

问题: 无颜色反应

原因:样品中有铜螯合剂;解决:1.透析,脱盐或稀释样品;2.增加工作液铜离子浓度(50:2)3.去除干扰物质

问题: 空白吸收好,但是标准品和样品颜色反应浅

原因:

1.强酸或强碱改变了工作液PH值;解决:透析,脱盐或稀释样品

2. 测量波长错误;解决:562nm检测

问题: 样品颜色比较深

原因:

1.蛋白浓度太高;解决:稀释样品

2.样品中有脂或脂蛋白;解决:加2%SDS

问题: 所有反应颜色深

原因:

1.缓冲液有还原剂;解决:透析或稀释样品

2.缓冲液有巯基;解决:去除干扰物质

问题:需要在不同波长测量。

原因:没有相应滤光片;解决:可以在540-590nm之间测量,但是灵敏度会降低。

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