残留菌体蛋白含量测定规程

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所属分类:蛋白质测序

1材料和试剂:

1.1.1包被液:碳酸盐缓冲液,PH9.6

1.1.2洗涤液:PBS-Tween20,PH7.4

1.1.3稀释液:0.5%BSA-PBS-Tween20,PH7.4

1.1.4底物缓冲液:柠檬酸-磷酸盐缓冲液,PH5.0

1.1.5底物液:邻苯二胺8mg溶于底物缓冲液20ml,30%H2O230ul

1.1.6终止液:1mol/LH2SO4

1.1.7兔抗大肠杆菌抗体

1.1.8 HRP酶联兔抗大肠杆菌抗体

1.1.9菌体蛋白标准:中国药品生物制品检定所提供,(10ug/ml)

1.2. 仪器:

1.2.1 96孔酶标板及稀释槽

1.2.2恒温培养箱(37℃)

1.2.3单头和八头微量移液枪

1.3.4酶标读数仪(490nm)

2. 操作步骤:

2.1包被用包被液稀释兔抗大肠杆菌抗体至10ug/ml,以100ul/孔加至96孔酶标板,置4℃湿盒过夜。(16-18小时)

2.2封闭:洗板3次,用洗涤液配1%BSA,以200ul/孔加至板内,置37℃湿盒2小时。

2.3加样:

2.3.1标准处理:用稀释液稀释菌体蛋白标准至下列浓度梯度—500、250、125、62.5、31.25、15.625、7.8125ng/ml.

2.3.2样品处理:用稀释液稀释样品至250ug/ml左右.

2.3.3将封闭好的酶标板洗3次,将标准和样品均以100ul/孔加至板内,置湿盒2小时.

3.4洗板3次,用稀释液1:1000稀释HRP酶联兔抗大肠杆菌抗体,以100ul/孔加至板内,置湿盒37℃1小时.

2.5洗板4-5次以100ul/孔加入新鲜配制的底物,置37℃湿盒20分钟.

2.6以50ul/孔加入终止液终止反应.

2.7将板放入酶标仪中,490nm单波长,应用计算机远程控制进行读数和数据分析.

3结果判断:

以标准品吸收值对标准品浓度作曲线,并以样品OD吸收值在曲线上读出相应菌体蛋白含量,按以下公式计算样品中菌体蛋白含量.

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