酵母RNA的提制

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所属分类:蛋白质测序

一、目的:
学习和掌握从酵母中提制RNA 的原理和方法,从而加深对核酸性质的认识。
二、原理:
提取和制备RNA 的首要问题是选RNA 含量高的材料。微生物是工业上大量生产核酸的原料,其中RNA 的提制以酵母最为理想,因为酵母核酸中主要是RNA(2.67~10.0%),DNA 很少(0.03~0.516%),而且菌体容易收集,RNA 也易于分离。此外,抽提后的菌体蛋白质(占干菌体的50%)仍具有很高的应用价值。
RNA 提制过程首先要使RNA 从细胞中释放,并使它和蛋白质分离,然后将菌体除去。再根据核酸在等电点时溶解度最小的性质,将pH 调至2.0~2.5,使RNA 沉淀,进行离心收集。然后运用RNA 不溶于有机溶剂乙醇的特性,以乙醇洗涤RNA 沉淀。提取RNA 的方法很多,在工业生产上常用的是稀碱法和浓盐法。稀碱法利用细胞壁在稀碱条件下溶解,使RNA 释放出来,这种方法提取时间短,但RNA 在稀碱条件下不稳定,容易被碱分解;浓盐法是在加热的条件下,利用高浓度的盐改变细胞膜的透性,使RNA 释放出来,此法易掌握,产品颜色较好。使用浓盐法提出RNA 时应注意掌握温度,避免在20~70℃之间停留时间过长,因为这是磷酸二酯酶和磷酸单酯酶作用的温度范围,会使RNA 因降解而降低提取率。在90~100℃条件下加热可使蛋白质变性,破坏磷酸二酯酶和磷酸单酯酶,有利于RNA 的提取。
三、实验材料、主要 仪器 和试剂
1.实验材料
活性干酵母;pH0.5~5.0 的精密试纸;冰块。
2. 仪器
(1)药物天平
(2)三角瓶(100mL)
(3)量筒(50mL)
(4)水浴锅
(5)电炉
(6)试管木夹
(7)离心管
(8)离心机(4 000r/min)
(9)烧杯(250mL, 50mL, 10mL)
(10)滴管及玻棒
(11)吸滤瓶(500mL)
(12)布氏漏斗(60mm)
(13)表面皿(8cm)
(14)烘箱
(15)干燥器
(16)紫外可见分光光度计
3. 试剂
(1)NaCl(化学纯)
(2)6mol/L HCl
(3)95%乙醇(化学纯)
四、操作步骤
1.提取
活性干酵母粉5g,倒入100mL 三角瓶中,加NaCl 5g,水50mL,搅拌均匀,置于沸水浴中提取1h。
2.分离
将上述提取液取出,立即用自来水冷却,装入大 离心管 内,以3 500r/min 离心10min,使提取液与菌体残渣等分离。
3.沉淀RNA
将离心得到的上清液倾于50mL 烧杯中,并置于放有冰块的250mL 烧杯中冷却,待冷至10℃以下时,用6mol/L HCl 小心地调节pH 至2.0~2.5。随着pH 下降,溶液中白色沉淀逐渐增加,到等电点时沉淀量最多(注意严格控制pH)。调好后继续于冰水中静置10min,使沉淀充分,颗粒变大。
4.抽滤和洗涤
上述悬浮液以3 000r/min 离心10min,得到RNA 沉淀。将沉淀物放在10mL 小烧杯内,用95%的乙醇5~10mL 充分搅拌洗涤,然后在铺有已称重滤纸的布氏漏斗上用 真空泵 抽气过滤,再用95%乙醇5~10mL 淋洗3 次。由于RNA 不溶于乙醇,洗涤不仅可脱水,使沉淀物疏松,便于过滤、干燥,而且可除去可溶性的脂类及色素等杂质,提高了制品的纯度。
5.干燥
从布氏漏斗上取下有沉淀物的滤纸,放在8cm 表面皿上,置于80℃烘箱内干燥。将干燥后的RNA 制品称重。
6.含量测定
称取一定量干燥后的RNA 产品配制成浓度为10~50μg/mL 的溶液,在751 型 分光光度计 上测定其260nm 处的光密度值,按下式计算RNA 含量:
酵母RNA的提制
式中:OD260nm 为260nm 处的光密度值;L 为比色杯的光径(cm);0.024 为1mL 溶液含有1μg RNA 的光密度值。
五、结果计算
根据含量测定的结果按下式计算提取率:
酵母RNA的提制
六、思考题
1.RNA 提制中注意事项是什么?
参考答案
1.主要注意事项为:避开 核酸酶 作用的温度范围20~70℃,防止RNA 降解。同时在调pH 值时,一定要缓慢小心,且要在低温下进行。此外,在抽滤洗涤时,要用乙醇洗涤,且不可用水洗,否则将导致RNA 部分溶解而造成损失,降低RNA 提取率。

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