蔗糖梯度分析

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所属分类:蛋白质测序

蛋白在蔗糖梯度中的沉降率可以用于与已经知道的S值与其在同梯度中蛋白相比来确定其S值。从而可用于计算蛋白的大约的分子量,也可用于鉴定两个蛋白的相互作用,如果他们在相同梯度出峰。

一、材料和试剂

1. 蔗糖(SigmaCatalog No.S0389)

2. 明胶(SigmaCatalog No.G9136)

二、仪器

1.离心机(BeckmanFalcon,TLS-55)

2.梯度混合器(Sigma)

三、步骤

1. 用与蛋白样品缓冲液相同的缓冲液制作10%和40%的蔗糖溶液。

2. 用的1%明胶包被管子,用1%的明胶溶液加满管子,倒出凝胶溶液并用ddH2O洗涤。

3. 制作10-40%蔗糖梯度

注意:梯度混合器有两个室,储存室和混合室,并用一个不互联的膜隔开。用另一个膜来调控从混合器中流出。在混合室中的磁力搅拌器可以帮助保持一个不变的梯度所有的混合器都有一个平面用于放在磁力搅拌器上。

4. 将梯度混合器放在磁力搅拌器上面,使其水平。将一个小的搅拌子放入混合室中。

5. 使所有瓣膜关闭,用1/2想要的梯度量加入每个室中,用40%在混合室,10%蔗糖在储存室。

6. 打开磁力搅拌器使得它轻轻的搅拌。

7. 将输出管放到一个离心管中,使起刚刚碰到接近顶部的边。

8. 同时打开两个膜,40%蔗糖溶液开始进入离心管,10%蔗糖开始与40%蔗糖混合。当梯度接近离心管的顶部关闭两个瓣膜。确定有足够的地方放顶部的梯度样品。

9. 把梯度的转子放在冷室中2~48 hrs,确定管子平衡并且样品在顶部,样品只占很少的体积(如100 μl 对于2.2 ml 梯度溶液)。

10. 55 000 rpm 离心2.5小时。

11. 收集组分并且用Western blotting 检测。醛缩酶(158 kD,7S)和甲状腺球蛋白(690 kD,19S)(Bio-RadLaboratories)并用于marker被用于一起检测。

四、配置方法

1. 10%蔗糖溶液:10 mg 蔗糖溶于100 ml ddH2O

2. 40%蔗糖溶液:40 mg 蔗糖溶于100 ml ddH2O

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