酵母核糖核酸的提取、水解及组成成分的鉴定

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所属分类:蛋白质测序

目的和要求

了解核糖核酸(RNA)的提取方法及其组成成分的定性测定。

原理

核酸在机体生命活动中具有重要意义,核酸可分为核糖核酸和脱氧核糖核酸两类。酵母中富含的核糖核酸在碱处理下成为可溶性的钠盐与蛋白质等其它成分分开,然后用乙醇提取。加酸水解核酸,可鉴定其组成成分。

用硫酸水解RNA时,可以生成磷酸、戊糖和碱基。各种成分以下列反应鉴定:

(1) 磷酸与钼酸铵 试剂 作用能产生黄色的磷钼酸铵沉淀。

(2) 核糖与地衣酚 试剂 反应呈鲜绿色。

(3) 嘌呤碱与硝酸银能产生白色的嘌呤银化物沉淀。

操作方法

一、酵母RNA的提取

(1)取酵母3克置于研钵中,加入25毫升0.5%氢氧化钠溶液研成匀浆。

(2)将匀浆移入三角瓶中,在沸水浴上加热水30分钟。

(3)离心沉淀10-15分钟。

(4)取上清液用3M醋酸4-5滴酸化至兰色石蕊试纸变红色 。

(5)一面搅拌一面加入含2%HCL的95%酒精溶液10毫升。

(6)离心5分钟,将沉淀用无水乙醇5毫升洗涤一次,离心5分钟,沉淀再用乙醚3毫升洗涤一次,离心5 分钟,回收乙醚。

(7)用手心握住 离心管 并不断搅拌使乙醚挥发而使RNA迅速干燥。

二、水解RNA

取1/2左右的RNA粉末于试管中加入8%硫酸4毫升在沸水浴上水解5分钟。

三、组成成分鉴定

(1)嘌呤碱基的检查

取水解液6滴,于试管中加氨水10滴,再加0.1M硝酸银溶液6滴,在沸水浴上加热,观察变化,何故?

(2)磷酸的检查

取水解液5滴,于试管中加5滴浓硝酸酸化,再加入5滴钼酸铵溶液在沸水浴上加热,冷却静止有何现象。

(3)核糖的检查

取水解液6滴,于试管中加10%氢氧化钠,使其成碱性,然后加地衣酚3毫升,在沸水浴上加热,观察变化,何故?

试剂和器材

一、试剂

(1)0.5% NaOH (2)3M 醋酸

(3)8% 硫酸 (4)无水酒精

(5)乙醚 (6)氨水

(7)含2% HCL的95%酒精 (8)浓硝酸

(9)0.1M AgNO3 (10)酵母

(11)石蕊试纸

(12)钼酸铵试剂:将2克钼酸铵溶解在100毫升10% 硫酸中。

(13)地衣酚试剂:100毫升浓盐酸加入100毫克三氯化铁,摇匀,贮存备用,使用前加入476毫克地衣酚。

二、器材

(1)试管 (2)电炉

(3)三角烧瓶 (4)研钵

(5) 离心机 (6)滴管

思考题

现有三瓶未知溶液,已知它们分别为蛋白质、糖和RNA,采用什么试剂或方法进行鉴定(请自行设计简便的实验)?

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