考马斯亮兰法(bradford法)蛋白质含量测定

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所属分类:蛋白质测序

一、实验原理

双缩脲法(biuret法)和folin—酚试剂法(lowry法)的明显缺点和许多限制,促使科学家们去寻找更好的蛋白质溶液测定的方法。

1976年由bradford建立的考马斯亮兰法(bradford法),是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点,因而正在得到广泛的应用。这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。

考马斯亮兰g-250染料,在酸性溶液中与蛋白质结合,使染料的最大吸收峰的位置(lmax),由465nm变为595nm,溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。经研究认为,染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸(特别是精氨酸)和芳香族氨基酸残基相结合。

在595nm下测定的吸光度值A595,与蛋白质浓度成正比。

bradford法的突出优点是:

1. 灵敏度高,据估计比lowry法约高四倍,其最低蛋白质检测量可达1mg。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大,蛋白质-染料复合物有更高的消光系数,因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比lowry法要大的多。

2. 测定快速、简便,只需加一种试剂。完成一个样品的测定,只需要5分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程,大约只要2分钟即可完成,其颜色可以在1小时内保持稳定,且在5分钟至20分钟之间,颜色的稳定性最好。因而完全不用像lowry法那样费时和严格地控制时间。

3. 干扰物质少。如干扰lowry法的K+、Na+、Mg2+离子、tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、edta等均不干扰此测定法。

此法的缺点是:

1. 由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同,因此bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差,在制作标准曲线时通常选用 g—球蛋白为标准蛋白质,以减少这方面的偏差。

2. 仍有一些物质干扰此法的测定,主要的干扰物质有:去污剂、 triton x-100、十二烷基硫酸钠(sds)和0.1n的naoh。(如同0.1n的酸干扰lowary法一样)。

3. 标准曲线也有轻微的非线性,因而不能用beer定律进行计算,而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。

二、试剂与器材

1. 试剂:

① 标准蛋白质溶液,用 g—球蛋白或牛血清清蛋白(bsa),配制成1.0mg/ml和0.1mg/ml的标准蛋白质溶液。

② 考马斯亮兰g—250染料试剂:称100mg考马斯亮兰g—250,溶于50ml 95%的乙醇后,再加入120ml 85%的磷酸,用水稀释至1升。

2. 器材:

① 可见光分光光度计

② 旋涡混合器

③ 试管16支

三、操作方法

1. 标准方法

① 取16支试管,1支作空白,3支留作未知样品,其余试管分为两组按表中顺序,分别加入样品、水和试剂,即用1.0mg/ml的标准蛋白质溶液给各试管分别加入:0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1ml,然后用无离子水补充到0.1ml。最后各试管中分别加入5.0ml考马斯亮兰g—250试剂,每加完一管,立即在旋涡混合器上混合(注意不要太剧烈,以免产生大量气泡而难于消除)。未知样品的加样量见下表中的第8、9、10管。

② 加完试剂2-5分钟后,即可开始用比色皿,在分光光度计上测定各样品在595nm处的光吸收值A595,空白对照为第1号试管,即0.1mlH2O加5.0mlg—250试剂。

注意:不可使用石英比色皿(因不易洗去染色),可用塑料或玻璃比色皿,使用后立即用少量95%的乙醇荡洗,以洗去染色。塑料比色皿决不可用乙醇或丙酮长时间浸泡。

考马斯亮兰法实验表

管 号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 标准蛋白质(1.0mg/ml) 0 0.01 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 未知蛋白质(约1.0mg/ml) 0.02 0.04 0.06 蒸馏水 0.1 0.09 0.08 0.06 0.04 0.02 0 0.08 0.06 0.04 考马斯亮蓝g-250试剂 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 每管中的蛋白质量(mg) 光吸收值(A595)

(3)用标准蛋白质量(mg)为横座标,用吸光度值A595为纵座标,作图,即得到一条标准曲线。由此标准曲线,根据测出的未知样品的A595值,即可查出未知样品的蛋白质含量。

0.5mg牛血清蛋白/ml溶液的A595约为0.50。

2. 微量法

当样品中蛋白质浓度较稀时(10-100mg/ml),可将取样量(包括补加的水)加大到0.5ml或1.0ml,,空白对照则分别为0.5ml或1.0ml H2O, 考马斯亮蓝g-250试剂仍加5.0ml,同时作相应的标准曲线,测定595nm的光吸收值。

0.05mg牛血清蛋白/ml溶液的A595约为0.29。

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