植物体内可溶性蛋白质含量的测定(福林-酚法的原理)

  • A+
所属分类:蛋白质测序

该方法是双缩脲法的发展,包括两步反应:

(1)在碱性条件下,蛋白质与铜作用生成蛋白质—铜络合物。

(2)此络合物将试剂磷钼酸—磷钨酸(FolIn试剂)还原,混合物深蓝色(磷钼蓝和磷钨蓝混合物),颜色深浅与蛋白质含量成正比。此方法操作简便,灵敏度比双缩脲法高100倍,定量范围为5~100μg蛋白质。FolIn试剂显色反应由酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸引起,因此样品中若含有酚类、柠檬酸和巯基化合物,均有干扰作用。此方法的缺点是有蛋白质的特异性影响,即不同蛋白质因络氨酸、色氨酸含量的不同而使显色强度稍有不同,标准曲线也不是严格的直线形式。

一、仪器与用具

试管若干;刻度移液管05Ml 1支,1Ml 1支,10Ml 1支;定量加样器;圆底烧瓶;冷凝管1套(带橡胶管);微量滴定管;小烧杯;微量进样器50μl 1支;721分光光度计;恒温水浴器;研钵;玻棒;离心机;离心管。

二、试剂

Na2WO4·2H2O;Na2MoO4·2H2O;85%H3PO4;浓HCl;Li2SO4·H2O;溴水;酚酞指示剂;Na2CO3;NaOH;CuSO4·5H2O;酒石酸钾钠;牛血清白蛋白。所用试剂均为化学纯或分析纯。

三、方法

1. 试剂的配制

(1)碱性铜试剂(相当于双缩脲试剂)的制备首先配制A液:4%碳酸钠(Na2CO3)溶液与0.2mol/L氢氧化钠(NaOH)溶液等比例混合(2%Na2CO3,0.1Mol NaOH);B液:1%硫酸铜(CuSO4·5H2O)溶液与2%酒石酸钾钠溶液等比例混合(0.5%CuSO4·5H2O,0.1%酒石酸钾钠)。在使用前将A液与B液按50∶1的比例混合即成。此为Folin-酚试剂甲液,此试剂只能使用1天。

酚试剂(相当于Folin试剂)的配备:称取钨酸钠(Na2WO4·2H2O)100g、钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)25g,加蒸馏水700Ml溶解于1500Ml的圆底烧瓶中。之后加入85%的H3PO450ml,浓HCl 100ml,安上回流装置(使用磨口接头,若用软木塞或橡皮塞时,就必须用锡铂纸包起来),使其慢慢沸腾10H。冷却后加入硫酸锂(Li2SO4·H2O)150g,水50ml,溴水2~3滴,不用回流装置开口煮沸15min,以释放出过量的溴。待冷却后稀释至1000ml,并过滤入棕色瓶中,密闭于冰箱中保存(冷却后溶液呈黄色,倘若仍呈绿色,须再滴加数滴液体溴,继续煮沸15min)。

使用时用标准NAOH溶液滴定,以酚酞作为指示剂,滴定终点由蓝变灰,滴定后算出酸的浓度。使用时大约加水1倍,使最终浓度相当于1Mol/L H+酸,此为FolIn-酚试剂乙液(Folin试剂)。

在测定时要注意,因为酚试剂仅在酸性条件下稳定,但此实验的反应只在PH值为10的情况下发生,所以当加酚试剂时,必须立即混匀,以便在磷钼酸—磷钨酸试剂被破坏前即能发生还原反应,否则会使显色程度减弱。

(2)标准蛋白质溶液的配制 称取25mg牛血清白蛋白,溶于100ml蒸馏水中,使最终浓度为250μg/ml。

2. 标准曲线的绘制

(1)取7支试管,编号后,分别加入0ml、0.1ml、0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml标准蛋白质溶液,用蒸馏水补足1Ml,使每管含蛋白量分别为0μg、25μg、50μg、100μg、150μg、200μg、250μg(必要时可做重复)。

(2)在每支试管中用定量加样器加入5ml甲液,混匀,于30℃下放置10min。

(3)在每支试管中喷射加入0.5ml乙液,立即振荡混匀,在30℃下保温30min。

  • 蛋白质组学业务咨询
  • 扫码咨询相关问题
  • weinxin
  • 代谢组学业务咨询
  • 扫码咨询相关问题
  • weinxin

发表评论

:?: :razz: :sad: :evil: :!: :smile: :oops: :grin: :eek: :shock: :???: :cool: :lol: :mad: :twisted: :roll: :wink: :idea: :arrow: :neutral: :cry: :mrgreen: