P53蛋白检测

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所属分类:蛋白质测序

野生型p53蛋白可以通过诱导凋亡而抑制肿瘤的生长,突变型p53基因丧失了诱导细胞凋亡的能力,从而增强了细胞的恶性转化能力,而且在恶性肿瘤常可检测出突变型p53基因。p53蛋白也可能参与化疗药物诱导的细胞凋亡。本法运用一步夹心免疫法,定量检测野生型或突变型p53蛋白。

样本来源

1. 人、鼠、兔的组织切片

2. 肿瘤细胞株

材料与试剂

1. 过氧化物酶标记的多克隆抗人-p53全抗体(检测抗体);

2. 洗涤缓冲液(10x);

3. 过氧化物酶底物液: 四甲基联苯胺(tetramethylmenzidine, TMB)液。

4. TMB终止液;

5. 孵育缓冲液;

6. 链霉亲和素与生物素化抗p53抗体(捕捉抗体)包被的微孔板。

操作步骤

1. 制备标本(如细胞裂解液或组织匀浆),离心10,000xg,10分钟;

2. 将离心后的上清液(水相)加至链霉亲和素与生物素化抗p53抗体预先包被的微孔板;

3. 加入抗-p53-过氧化物酶(1:15)室温孵育2小时;

4. 室温,用1x洗涤缓冲液洗板5次,每次1分钟;

5. 加入过氧化物酶底物液,室温孵育,10-20分钟;

6. 加入TMB终止液,室温反应1分钟,测定450nm吸光度;或直接测定370nm的吸光度。

结果判断

P53蛋白的含量与显色反应的强度成正比。

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