影响紫外吸收法测定蛋白质/DNA浓度的因素

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所属分类:蛋白质测序

紫外吸收法测定蛋白质/DNA浓度的最大特点就是操作简单、测量迅速,而且不需要引入试剂;但是它也面临着很多问题,诸如测量准确性的问题。本节将讨论影响测定的一些主要因素。

(1)蛋白质的不同对测定结果的影响。

由于蛋白质是生物大分子,而紫外吸收往往是其分子内的小基团所引起的,例如酪氨酸、苯丙氨酸,色氨酸和肽键等等。因此当蛋白质不同,其包含的上述小基团含量发生变化时,就会影响蛋白质含量的测定。然而蛋白质种类繁多,结构复杂,很难对其进行有效的归类。例如人体内含蛋白质的种类约有10万种,整个生物界的蛋白质种类估计有100亿种。

建议:测量过程中如果条件允许,应尽量使用相近的蛋白质做标准曲线,修正测量参数,以便得到更为准确的数值。

(2)溶液中干扰物质的影响。

由于蛋白质所包括的具有紫外吸收的小基团为常见基团,其产生紫外吸收的特异性并不强,很多具有类似结构的有机溶剂都会有类似的紫外吸收,如醇、酮、醛、醚、有机酸、酰胺类,这些混入蛋白质溶液都会对测量产生干扰。另外,一些高浓度的无机化合物也会对蛋白质的含量测定产生干扰,例如NaOH、NaCI等等。

建议:测量时应尽量排除干扰物质,同时选择合适的参比溶液。

(3)溶剂吸收的影响。

如果以一些在紫外区有吸收的物质做溶剂(例如醇、酮类),会对测量结果产生很大的影响。

建议:测量时尽量不要使用此类溶剂,或者在测量时选择合适的参比。

(4)PH对测定的影响。

PH变化时对蛋白质含量测定的影响非常大,例如:下图为Tyr的吸收谱线与PH的关系。由图可以发现,PH=6和PH=13时,光吸收度已经有了非常大的差异。

lmax at pH 6: 274 nm

lmax at pH 13: 295 nm

建议:测定样品时不要使溶液处于过酸或者过碱的状态,同时样品的PH值要与标准品的PH值尽量保持一致。

(5)环境极性、蛋白质构象、蛋白质折叠与变性都会对蛋白含量的测定产生影响。

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