蛋白质的性质实验:蛋白质和氨基酸的呈色反应

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所属分类:蛋白质测序

1、目的

(1)了解蛋白质的基本结构单位及主要连接方式。

(2)了解某些蛋白质和氨基酸的呈色反应原理。

(3)学习几种常见的鉴定蛋白质和氨基酸的方法

2、原理

蛋白质分子中某些基团与显色剂作用,可生成特定颜色,颜色不同,蛋 白质所含氨基酸不同,但颜色反应不是蛋白质专一反应,非蛋白质物质亦可 产生相同颜色反应,不能用呈色反应来确定是否为蛋白质,但某些颜色反应 可用于蛋白质定量。

(1)双缩脲反应。

在碱性溶液中,双缩脲(NH2-CO-NH-CO-NH2)与Cu2+结合,生成紫 红色的络合物,这一呈色反应成为双缩脲反应。蛋白质分子中含有两个以上 的肽键,具有类似于双缩脲的结构,因此能发生双缩脲反应。 生成的紫红色络合物,其颜色深浅与蛋白质的浓度成正比,而与蛋白质 的分子质量及氨基酸成分无关。

(2)茚三酮反应。

在加热条件下,氨基酸或肽与茚三酮反应生成紫色(与脯氨酸反应生成 红色)化合物的反应。

(3)黄色反应。

凡含有苯基的化合物均可与浓硝酸作用产生硝基苯衍生物。该化合物在 碱性溶液中进一步形成深橙色的硝醌酸钠。这个化合物的生成与色氨酸、酪 氨酸有关。绝大多数蛋白质都含有带苯环的氨基酸,因此均有黄色反应。皮 肤、指甲等遇浓硝酸变黄即为这个反应的结果。

(4)坂口反应。

在次溴酸钠或次氯酸钠存在的条件下,许多含有胍基的化合物(如胍乙 酸、甲胍、胍基丁胺等)能与α-萘酚发生反应生成红色物质。在20 种氨基酸 中唯有精氨酸含有胍基,所以只有它呈正反应。

生成的氨被次溴酸钠氧化生成氮。该反应中过量的次溴酸钠是不利的, 因其能进一步缓慢氧化,使产物破裂分解,引起颜色消失。但加入适量尿素 可破坏过量的次溴酸钠。酪氨酸、色氨酸和组氨酸也能降低产生颜色的强度。 甚至会阻止颜色的生成。

该反应灵敏度达1:250 000。因此常用于定量测定精氨酸的含量和定 性鉴定含有精氨酸的蛋白质。

(5)考马斯亮蓝反应。

双缩脲法(Biuret 法)和Folin—酚 试剂 法(Lowry 法)的明显缺点和许 多限制,促使科学家们去寻找更好的蛋白质溶液测定的方法。

1976 年由Bradford 建立的考马斯亮兰法(Bradford 法),是根据蛋白质 与染料相结合的原理设计的。这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突 出优点,因而正在得到广泛的应用。这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测 定法。

考马斯亮兰G-250 染料,在酸性溶液中与蛋白质结合,使染料的最大 吸收峰的位置(lmax),由465nm 变为595nm,溶液的颜色也由棕黑色变为 兰色。经研究认为,染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸(特别是精氨酸) 和芳香族氨基酸残基相结合。在595nm 下测定的吸光度值A595,与蛋白质浓 度成正比。

Bradford 法的突出优点是:

(1)灵敏度高,据估计比Lowry 法约高四 倍,其最低蛋白质检测量可达1mg。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜 色变化很大,蛋白质-染料复合物有更高的消光系数,因而光吸收值随蛋白 质浓度的变化比Lowry 法要大的多。

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