蛋白质含量测定的方法(Bradford 方法)

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所属分类:蛋白质测序

原理:

这一方法基于考马斯亮蓝G-250 有红蓝两种不同的形式。在一定浓度的乙醇及酸性条件下,可配成淡红色的溶液,当与蛋白质结合后,产生蓝色化合物,反应迅速而稳定。反应化合物在465-595nm处有最大的光吸收值,化合物颜色的深浅与蛋白浓度的高低成正比关系,因此可检测595nm的光吸收值的大小计算蛋白的含量。

溶液:

1)Bradford储存液

100ml95%乙醇

200ml88%磷酸

350mgServaG蓝

室温下长期保持稳定。

2)Bradford工作液

425ml双蒸水

15ml95%乙醇

30ml88%磷酸

30ml Bradford储存液

用滤纸过滤,保存于室温棕色瓶中,可保存数周,但在使用前需要过滤。

3)配制1mg/ml牛血清蛋白(BSA)

做标准曲线:

取样品即可测量。

注意事项:

1、样品制备,样品制备是做好2-d 的关键,样品中离子浓度不能过大,最好用新鲜的样品提取蛋白质,如果不确定蛋白提取情况,建议先跑sds-page检验。

2、上样量的问题, ipg 胶条是13 厘米的上样量在50ng-80ng之间,上样量不合适,丰度低的将会被丰度高的所遮盖。

3、ipg 胶条ph 的选择,根据不同样品选择不同pH值。

4、针对不同的蛋白质,分离胶的浓度需调整。

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