蛋白质定量分析

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所属分类:蛋白质测序

Bradford 的dye-binding method 是利用Coomassie brilliant blue G-250 (CBG) 可与蛋白质结合而变色的特性来定量 (Bradford, 1976);若试样中的蛋白质量较多,则结合到蛋白质而变色的CBG 也多,因而呈色较深。下例是以一组标准蛋白质为对象,制作一条蛋白质量与吸光度的标准校正线。

仪器用具:ELISA光度计 (Dynatech) 可在一分钟内测完一片滴定盘微量滴定盘 (microtiter plate, Nunc F96 Maxisorb 442404)Micro test tubes, 大头针或喷火枪

药品试剂:(a) Buffer A-0(b) BSA标准品 (Bio-Rad, bovine serum albumin, 100 μg/mL)(c) 未知浓度样本 (unknown BSA, 0.8 mL, 由教师调配发给)(d) Dye Reagent (Bio-Rad 500-0006) 先以水稀释四倍备用。 以染料Coomassie brilliant blue G-250 配制的溶液,勿与胶体电泳染色用的CBR-250 混淆,各有其使用上的特色,不要互用。

标准品及样本:

标准品系列:使用小试管准备一组BSA (b) 标准品的系列稀释:

◆ 配制一定要精准,否则校正直线不会很准确;各种试剂的添加,若自稀往浓取样,则可以不用换吸管头。

未知样本:再以上述unknown BSA (c) 准备两种未知样本:Label 未知样本 (c) Buffer A-0 Final Conc.

一般样本:1) 通常由色析法所收集到的各分划样本,都可以直接进行蛋白质定量分析;但若其中含有某些干扰因子 (如含有Triton),或样本的浓度太浓,都必须将样本稀释后再测。2) 同一样本的若干不同稀释浓度,所测出来的最终蛋白质浓度会有差异,通常是以稀释度大者较为准确。

方法步骤:

1) 每槽先加好50 μL标准品 (#0, #1 … #5) 或未知样本 (X1, X2),以二重复加入96 孔滴定盘中,如图所示。


微量滴定盘的使用

2) 每槽再加入200 μL Dye-Reagent (d),在全部样本槽加完前,不要中断添加;同时小心避免气泡产生。

3) 轻拍滴定盘一侧,使添加的各成份均匀混合,注意Dye-Reagent 密度较大,很容易沉积在下方而分层。 若还有小气泡,小心以大头针刺破,大量时可用喷火枪火焰烧破。

4) 静置室温10 min.

5) 以ELISA reader测量570 nm (或595 nm) 的吸光值。

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