考马斯亮蓝G—250染色方法

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所属分类:蛋白质测序

一、原理:

考马斯亮蓝G—250法于1976年由Bradform建立。考马斯亮蓝G—250具有红色和蓝色两种色调,在酸性溶液中,其以游离态存在呈棕红色,当它与蛋白质通过疏水作用结合后,变为蓝色。色素对可见光谱的最大吸收值从465nm转移到595nm处。蛋白质和色素的结合反应很快速,约在2分钟左右的时间内达到平衡,在室温1小时之内是稳定的。在0.01一1.0mg蛋白质/m1范围内,蛋白质含量与A 595值呈正比。

二、染液配制:

100mg的考马斯克蓝G—250溶解于50m1 95%的乙醇中,加入85%(w/V)的磷吱l00m1.
加水定容到1L

(一)标准曲线的绘制 在试管中分别加入含0、10、20、30、40、50、60ug标准蛋白质
溶液,用水补足到60ul,加3m1染色液,混匀后室温放置15分钟,至595nm处比色测定。以蛋白质含量为横坐标,A595的值为纵坐标绘制标准曲线。

(二)测定 取未知浓度的样品60ul,同上测定,从标准曲线上查出相应的含量。
该方法反应快、操作简便、消耗样品少,但不同蛋白质间的差异大,标准曲线的线性不好,显色受时间和温度影响较大。考马斯亮蓝染色能力强,特别要注意比色杯的清洗。较高浓度的去污剂(Triton x—100,SDS等)、尿素和硫酸铵对测定有干扰。

色素结合法大约是40年代开始发展起来的方法,先后有过用金程G,氨基黑10B,甲基橙、溴酚兰等分别进行蛋自质含量测量的报道。

还有一些用于微量蛋白质定量的方法,如根据和银相结合的能力,可测定含量在15—2000pg的蛋白质含量,比考马斯亮蓝法灵敏100倍。样品先用甘油醛处理,再与氨银溶液作用,10分钟后,加硫代硫酸钠终止反应,可在420nm处测定。蛋白质与银复合物形成快,显色稳定。

蛋白质和胶体余的结合,可以测出20pg的蛋白质量。

值得注意的是,染料结合法以其简便、快速的特点,应用越来越广泛,尤其是用于很亮蛋白的测定

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