组织和细胞总RNA提取(TRIzol法)

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所属分类:蛋白质测序

TRIzol RNA 提取 试剂 盒是由 GIBCO BRL 公司推出专供提取 RNA 的产品,其操作方便、快捷。

(一) 试剂 准备

1 . TRIzol 试剂。

2 .氯仿

3 .异丙醇

4 . 75% 乙醇( DEPC H 2 O 配制)

5 . DEPC H 2 O

(二)操作步骤

1 . 样品处理:

(1)培养细胞:收获细胞 1-5×10 7 ,移入 1.5ml 离心管 中,加入 1ml Trizol ,混匀,室温静置 5min 。
(2)组织:取 50-100mg 组织(新鲜或 -70 ℃ 及液氮中保存的组织均可)置 1.5ml 离心管 中,加入 1ml Trizol 充分匀浆,室温静置5 min 。

2 .加入 0.2ml 氯仿,振荡 15s ,静置 2min 。

3 . 4 ℃ 离心, 12000g × 15min ,取上清。

4 .加入 0.5ml 异丙醇,将管中液体轻轻混匀,室温静置 10min 。

5 . 4 ℃ 离心, 12000g × 10min ,弃上清。

6 .加入 1ml 75% 乙醇,轻轻洗涤沉淀。 4 ℃ , 7500g × 5min ,弃上清。

7. 晾干,加入适量的 DEPC H 2 O 溶解( 65 ℃ 促溶 10-15min )。

(三)注意事项

1 .样品量和 Trizol 的加入量一定要按步骤( 1 )的比例,不能随意增加样品量或减少 Trizol 量,否则会使内源性 RNase 的抑制不完全,导致 RNA 降解

2 .实验过程必须严格防止 RNsae 的污染。

(四)总 RNA 定量

RNA 定量方法与 DNA 定量相似。 RNA 在 260nm 波长处有最大的吸收峰。因此,可以用 260nm 波长分光测定 RNA 浓度, OD 值为 1 相当于大约 40 μ g/ml 的单链 RNA 。如用 1cm 光径,用 ddH 2 O 稀释 DNA 样品 n 倍并以 ddH 2 O 为空白对照,根据此时读出的 OD 260 值即可计算出样品稀释前的浓度:
RNA ( mg/ml ) =40 × OD 260 读数×稀释倍数 (n)/1000

RNA 纯品的 OD 260 /OD 280 的比值为 2.0 ,故根据 OD 260 /OD 280 的比值可以估计 RNA 的纯度。若比值较低,说明有残余蛋白质存在;比值太高,则提示 RNA 有降解。

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