离子交换色谱

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所属分类:蛋白质测序

基本原理

离子交换色谱是将离子交换基因(CM、SP、Q、DEAE等)键合于一定的惰性载体(纤维素、交联葡聚糖,交联琼脂糖等)之上,并以此作为固定相,依据样品所带电荷的不同,从而与固定相上的离子交换基团相互作用的程度不同而进行分离的一种色谱方法。离子交换色谱技术已广泛用于蛋白质、多肽、寡核苷酸、病毒、噬菌体、多糖等的纯化。

离子交换剂是在载体上键合了一些离子交换基团,而离子交换基团在水溶液中通过电离释放出游离的离子,这些离子可带正电或带负电,可以被溶液中的其它带相同电荷的离子取代,并对离子交换剂有较强的结合力。结合力的大小不仅受离子与离子交换剂之间作用力的影响,而且主要受离子浓度的影响,这个过程中的作用力是静电引力,离子交换的原理是静电相互作用。

蛋白质在离子交换色谱上的保留时间取决于蛋白质在相应色谱条件下所带静电荷的多少,而蛋白质所带静电荷的多少是由蛋白质分子的pI和所处溶液环境的pH共同决定的。在酸性条件下,蛋白质带正电荷;在碱性条件下,蛋白质带负电荷。在阳离子交换柱上,只有pI大于流动相pH的蛋白质在柱子上保留,而pI小于或等于流动相pH的蛋白质不保留,即使它们的pI值彼此之间有差异,也都作为溶剂峰同时被直接冲洗出来。而被保留的蛋白质出峰顺序则是pI小的先出峰,pI大的后出峰。在阴离子交换柱上情况则恰恰相反。

离子交换色谱过程分为四个阶段:平衡-吸附-解吸附-再生,其中吸附和解吸附是主要阶段,现以纯化TNF过程中应用的Q-Sepharose FF和SP-Sepharose FF为例说明。

试剂的配制

1,配制pH8.5 20mmol/L Tris-HCl含1mmol/L EDTA溶液(或其贮备液,临用时稀释即可)滤后使用。

2,配制pH7.5 20mmol/L的PB缓冲液,过滤后使用。

操作步骤

1,样品的预处理

2,样品的平衡

将实验一中50%饱水硫酸铵沉淀、离心得到的上清液,置于透析袋中,于20~40倍体积的pH8.5 20mmol/L Tris-HCl,1mmol/L EDTA的缓冲液中,4℃搅拌透析24h,中间换透析液3~4次,4℃ 12000rpm离心15min,收集上清,测定蛋白浓度,记录体积。

3,阴离子柱Q-Sepharose FF的平衡及上样

取阴离子交换基质Q-Sepharose FF装柱,柱体积5.4×20cm用pH8.5 20mmol/L Tris-HCl 1mmol/L EDTA 缓冲液流洗平衡层析柱,调整好蛋白检测仪的量程及记录仪灵敏度。将收集的上清液以8ml/min流速上样。平衡缓液冲直至流出液吸光值恢复至基线。收集穿过峰,量体积,测蛋白含量。

4,洗脱

洗脱液A为pH8.5 20mmol/L Tris-HCl,1mmol/L EDTA缓冲液,洗脱液B为含终浓度为1mol/L NaCl的A液进行线性梯度洗脱(根据纯化条件设定的纯化工艺),收集各洗脱峰量体积,测蛋白浓度,进行SDS-PAGE或进行活性鉴定TNF所在峰。

5,将活性峰用pH7.5 20mmol/L PB透析24h,中间换液3次。离心,取上清并量其体积,测蛋白浓度。

6,阳离子柱SP-Sepharose FF的平衡及上样

取阳离子交换基质SP-Sepharose FF装柱,柱体积2.5×10cm,用pH7.5 20mmol/L PB缓冲液流洗平衡层析柱,调整好蛋白检测仪的量程及记录仪的灵敏度,将透析、离心后的TNF的峰液以4ml/min的流速上样,用平衡液洗至基线,收集穿过峰,量体积,测蛋白浓度。

7,洗脱

阳离子层析柱SP-Sepharose FF的洗脱液A为pH7.5 20mmol/L PB,洗脱液B为含1mol/L NaCl的A液进行线性梯度洗脱,收集各洗脱峰,量体积,测蛋白质浓度,进行SDS-PAGE或活性鉴定。

8,后处理

进行TNF的纯度、活性等鉴定,按要求分装加赋形剂冷冻干燥后制成一定效价的TNF产品。

附 离子交换剂的选择

1,剂型的选择

在决定选择离子交换剂的类别之前,先要了解所研究的生物大分子保持生物活性和可溶解性的pH范围,然后根据其等电点以及其在上述pH范围内的电泳行为观察大分子的带电情况,再据此选择合适的离子交换剂。具体方法是;在流动相pH条件下进行电泳,向阳极泳动的蛋白质,可被阴离子交换剂吸附,因此,选择阴离子交换色谱;反之,向阴极泳动的蛋白质,可被阳离子交换剂吸附,应选择阳离子交换色谱。

通常,弱离子交换剂用来分离高静电作用力的蛋白质,强离子交换剂用来分离低静电作用力的蛋白质。

2,粒度的选择

离子交换剂粒度的大小对吸附量的影响不大,主要是对分辨率和流速产生影响。用粗颗粒填料填充的柱子不紧密,颗粒间隙大,容易引起区带扩散;由于颗粒大,同样吸附量的粗颗粒占柱床体积大,使形成的峰变宽。这些都会导致色谱分辨率下降。但是颗粒大流速快,分离速度快,使纯化时间缩短。细颗粒填料可填充成为致密的吸附床,分辨率高,但流速慢,柱压高。我们可根据自己工作的需要进行选择,如果为保持欲分离组分的生物学活性需要缩短分离时间,在大量制备基因工程产品时,可选用粗颗粒。如果要得到高分辨率,可选用超细颗粒。通常我们在实验室工作中采用的是细或中等粗细的颗粒。

3,缓冲液的选择

在离子交换色谱中,选择合适的缓冲体系,保持准确的流动相pH值更显得尤为关键。选择缓冲液时应满足以下要求:
(1)不破坏蛋白质的结构,不影响蛋白的活性。
(2)对人体无毒无害。
(3)缓冲容量大,在所选择pH范围内有足够缓冲能力的前提下,离子浓度越小越好。
(4)使用阳离子交换时应用阴离子缓冲剂,使用阴离子交换时应用阳离子缓冲剂,以避免不必要的离子交换过程。
(5)不干扰对分离物的鉴定。

目前阳离子交换色谱常用缓冲液离子有烷基胺、氨基乙醇胺、乙二胺、咪唑、Tris,吡啶等,其中Tris最为常用;阴离子交换色谱常用的缓冲液离子有醋酸盐、巴比妥酸盐、柠檬酸盐、甘氨酸,磷酸盐等,其中醋酸盐和磷酸盐最为常用。

在实际工作中,我们根据不同的流动相 pH条件来决定采用何种缓冲体系。例如:流动相pH3-5时,我们采用甲酸铵缓冲液;流动相pH4-6时,我们采用醋酸钠或醋酸钾缓冲液;流动相pH6-8时,我们采用磷酸钠或磷酸钾缓冲液。此外,Tris-盐酸缓冲液的pH范围为7-9,Tris-磷酸缓冲液的pH范围为6-9,我们都经常选用。

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