原位微量BCA蛋白定量法

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所属分类:蛋白质测序

简述:

传统标准的BCA蛋白定量分析方法常规均使用试管或者微孔板进行检测,通过对传统方法进行改进,可使用BioTek公司的Take3TM 超微量多体积检测板进行原位微量BCA法蛋白定量分析。待测蛋白样品和BCA工作缓冲液按照顺序直接加在Take3TM板的微量定量孔处、温浴,使用EpochTM 微孔板分光光度计进行检测。和传统标准BCA方法(BCA工作缓冲液和蛋白质样品体积比为20:1)相比,该方法的蛋白检测灵敏度有明显的提高。相比与Mini-BCA分析方法,原位分析方法更加精确。

介绍

BCA法是十分常用的蛋白质比色定量方法,很多试剂供应商都提供基于比色皿和微孔板的BCA蛋白定量试剂盒。BCA蛋白定量法相对于其它比色定量法具有操作简单、稳定、灵敏度高等优点。相对于蛋白质的固有的280nm吸收峰检测,BCA检测法提高了蛋白检测灵敏度和特异性,消除了核酸的干扰,核酸干扰在对细胞裂解物或其他生物样品进行蛋白定量时总是一个难以避免的干扰。在碱性条件下,蛋白将Cu2+ 还原为Cu+ ,Cu+ 与BCA 试剂形成紫色络合物,如图1,其吸光值与蛋白浓度成正比。测定在562nm 处的吸收值,并与标准曲线对比,即可计算待测蛋白的浓度。


图1. BCA法蛋白质定量。Cu(BCA)2耦合物在592nm有一很强的吸收值,7700L/mol/cm。

近几年开发的一些精密的检测仪器,都可以使用短光程、微量体积的样品进行比色定量,例如NanoDrop(ThermoFisher Scientific)。这个仪器内置了蛋白质280nm直接定量法,这种方法可以有效的避免浪费样品且操作简单。在直接蛋白定量的基础上,这些仪器还发展了蛋白质比色定量法,例如BCA法。通过调整蛋白质和BCA工作缓冲液的相对体积比,由原来的20:1调整为1:1,这种微量定量方法转换校准曲线的工作范围,使之更适合于微孔板或短光程检测,这种方法叫Mini-BCA法。然而对于这些通过把样品加在检测基座上的仪器来讲,蛋白质和BCA工作缓冲液必须先在一个额外的试剂槽里进行混匀和温浴,然后才能滴加到检测基座上进行检测。这样会增加操作的复杂性,增加了样品的浪费。

这里我们介绍一下如何使用Take3 超微量多体积检测板进行原位微量BCA蛋白定量法。使用Take3 超微量多体积检测板进行Mini-BCA法检测操作步骤简单,整个流程和使用典型的96孔微孔板检测相似,直接把BCA工作缓冲液和样品滴加在Take3板的微孔处,不需要先在其它容器混匀进行颜色反应。这样做的好处是可以提高操作的便捷性,每次检测只需要2ul样品,非常节约样品。

实验材料和方法检测试剂盒(Sigma-Aldrich公司)、小牛血清(BSA)(Sigma-Aldrich公司)。我们使用两种实验方法来进行BCA检测。

第一种方法

按照NanoDrop技术手册推荐的“Mini-BCA”法。其简要流程是:BCA检测系统混合好的10ulBCA工作缓冲液和10ul的标准蛋白或待测的10μl样品(1:1)在试管中混匀,37℃温浴30分钟后进行检测。

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