考马斯亮蓝G250法测定蛋白质含量定

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所属分类:蛋白质测序

一、目的
学习和掌握考马斯亮蓝G-250 测定蛋白质含量的原理和方法。

二、原理
考马斯亮蓝G-250(Coomassie brilliant blue G-250)测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝G-250 在游离状态下呈红色,最大光吸收在488nm;当它与蛋白质结合后变为青色,蛋白质-色素结合物在595nm 波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比,因此可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝G-250 结合在2min 左右的时间内达到平衡,完成反应十分迅速;其结合物在室温下1h 内保持稳定。该法是1976年Bradford 建立,试剂配制简单,操作简便快捷,反应非常灵敏,灵敏度比Lowry 法还高4 倍,可测定微克级蛋白质含量,测定蛋白质浓度范围为0~1 000μg/mL,是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。

三、材料、主要 仪器 和试剂
1.实验材料
新鲜绿豆芽

2.主要 仪器
(1)分析天平、台式天平
(2)刻度吸管
(3)具塞试管、试管架
(4)研钵
(5)离心机、离心管
(6)烧杯、量筒
(7)微量取样器
(8)分光光度计

3. 试剂
(1)牛血清白蛋白标准溶液的配制:准确称取100mg 牛血清白蛋白,溶于100mL 蒸馏水中,即为1 000μg/mL 的原液。
(2)蛋白 试剂 考马斯亮蓝G-250 的配制:称取100mg 考马斯亮蓝G-250,溶于50mL90%乙醇中,加入85%(W/V)的磷酸100mL,最后用蒸馏水定容到1 000mL。此溶液在常温下可放置一个月。
(3)乙醇
(4)磷酸(85%)

四、操作步骤
1.标准曲线制作
(1)0~100μg/mL 标准曲线的制作:取6 支10mL 干净的具塞试管,按表1 取样。盖塞后,将各试管中溶液纵向倒转混合,放置2min 后用1cm 光经的比色杯在595nm 波长下比色,记录各管测定的光密度OD595nm,并做标准曲线。

考马斯亮蓝G250法测定蛋白质含量定

表1 低浓度标准曲线制作

(2)0~1 000μg/mL 标准曲线的制作:另取6 支10mL 具塞试管,按表2 取样。其余步骤同(1)操作,做出蛋白质浓度为0~1 000μg/mL 的标准曲线。
表2 高浓度标准曲线制作

2.样品提取液中蛋白质浓度的测定
(1)待测样品制备:称取新鲜绿豆芽下胚轴2g 放入研钵中,加2mL 蒸馏水研磨成匀浆,转移到 离心管 中,再用6mL 蒸馏水分次洗涤研钵,洗涤液收集于同一 离心管 中,放置0.5~1h 以充分提取,然后在4 000r/min 离心20min,弃去沉淀,上清液转入10mL 容量瓶,并以蒸馏水定容至刻度,即得待测样品提取液。
(2)测定:另取2 支10mL 具塞 试管 ,按下表取样。吸取提取液0.1mL(做一重复),放入具塞刻度 试管 中,加入5mL 考马斯亮蓝G-250 蛋白试剂,充分混合,放置2min 后用1cm 光径比色杯在595nm 下比色,记录光密度OD 595 nm,并通过标准曲线查得待测样品提取液中蛋白质的含量X(μg)。以标准曲线1 号试管做空白。

五、结果计算

式中:X 为在标准曲线上查得的蛋白质含量(μg)。

六、附 注
1.Bradford 法由于染色方法简单迅速,干扰物质少,灵敏度高,现已广泛应用于蛋白质含量的测定。
2.有些阳离子,如K + 、Na + 、Mg 2+ 、(NH 4 ) 2 SO 4 、乙醇等物质不干扰测定,但大量的去污剂如TritonX-100、 SDS 等严重干扰测定。
3.蛋白质与考马斯亮蓝G-250 结合的反应十分迅速,在2min 左右反应达到平衡;其
结合物在室温下1h 内保持稳定。因此测定时,不可放置太长时间,否则将使测定结果偏低。

七、思考题
1.制作标准曲线及测定样品时,为什么要将各 试管 中溶液纵向倒转混合?
参考答案
1.将各 试管 中溶液纵向倒转混合目的是使反应充分,并且使整个反应液均一,否则在比色测定时,结果会有较大偏差,使标准曲线的制作不标准,后续的测定结果就不可靠。

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