蛋白质浓度测定:紫外分光光度法

  • A+
所属分类:蛋白质测序

蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸、色氨酸等芳香族氨基酸。它们具有吸收紫外光的性质,其吸收高峰在280nm波长处,且在此波长内吸收峰的光密度值与其浓度成正比关系,故可作为蛋白质定量测定的依据,但由于各种蛋白质的酪氨酸和色氨酸的含量不同,故要准确定量,必需要有待测蛋白质的纯品作为标准来比较,或且已经知道其消光系数作为参考。另外,不少杂质在280nm波长下也有—定吸收能力,可能发生干扰。其中尤以核酸(嘌呤和嘧啶碱)的影响更为严重。

然而核酸的最大吸收峰是在260nm。因此溶液中同时存在核酸时,必须同时测定OD260nm,与OD280nm。,然后根据两种波长的吸收度的比值,通过经验公式校正,以消除核酸的影响而推算出蛋白质的真实含量。

本法操作简便迅速,且不消耗样品(可以回收),多用于纯化之蛋白质的微量测定。主要缺点:当待测的蛋白质与标准蛋白质中的酪氨酸和色氨酸含量差异较大时,则产生—定误差,混有核酸时必须分别测定280nm和260nm两处的OD值,再按公式推算蛋白质含量。

[操作]

取试管7支,各管混匀,盛于石英杯中,用紫外分光光度计,以空白管调节零点,分别于280nm、260nm波长下测定各管光密度。

[计算]

(一)直接根据标准液与待测液的光密度值(OD280nm),或从标准曲线,求得样本蛋白质含量。

以标准管各管光密度值为纵坐标,以蛋白质浓度为横坐标绘制标准曲线,然后根据测定管光密度值,直接查标准曲线求得样本中蛋白质的含量。

1. 选一种与待测样本蛋白质氨基酸组成相近似的蛋白质纯品,用生理盐水稀释至浓度为lmg/m1,作为稀释标准蛋白质溶液。

2.用生理盐水稀释待测样本蛋白质至浓度约为lmg/m1,即为稀释样本蛋白质溶液。

(二)利用经验公式直接计算样本蛋白质含量,

准确吸取血清样本0.1ml,置于50ml容量瓶中,用生理盐水稀释至刻度,即500倍稀释,在280nm和260nm两处波长分别测得光密度值、再按下列公式计算。

1、OD280/OD260<1.5时,用Lowry-Kalokar公式:

样本蛋白质含量(mg/m1)=1.45OD280一0.74OD260

2、OD280/OD260﹥1.5时,用Lamber-Beer定律计算:

样本蛋白质含量(mg/m1)= OD280/K×L=(OD280/6.3×1)×10g/L

本实验样品:牛血清白蛋白E1%cm=6.3(100ml/cm.g)

K:克分子消光系数;E1%cm:百分比吸光度的吸光系数;

注:不同蛋白质中的酪氨酸和色氨酸含量有差异,故标准管与测定管的蛋白质氨基酸组成应相似,以减小误差。

[器材]

(一)UV-9200紫外分光光度计

(二)50ml容量瓶

[试剂]

(一)生理盐水

(二)清蛋白(人或牛)纯晶

(三)待测样本蛋白质:用双缩脲法测定蛋白质的样品用生理盐水稀释而成。

  • 蛋白质组学业务咨询
  • 扫码咨询相关问题
  • weinxin
  • 代谢组学业务咨询
  • 扫码咨询相关问题
  • weinxin

发表评论

:?: :razz: :sad: :evil: :!: :smile: :oops: :grin: :eek: :shock: :???: :cool: :lol: :mad: :twisted: :roll: :wink: :idea: :arrow: :neutral: :cry: :mrgreen: