质谱原理(六)

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所属分类:蛋白质谱技术

ESI和APCI的异同!

ESI 为电喷雾,即样品先带电再喷雾,带电液滴在去溶剂化过程中形成样品离子,从而被检测,对于极性大的样品效果好一些;

   APCI
为大气压力化学电离源,样品先形成雾,然后电晕放电针对其放电,在高压电弧中,样品被电离,然后去溶剂化形成离子,最后检测,对极性小的样品效果较好。

   ESI 的软电离程度较APCI
的还小,但其应用范围较APCI 的大,只有少部分ESI 做不出,可以用APCI 辅助解决问题,但是APCI还是不能解决所有ESI
解决不了的问题。

    一般用ESI 和 APPI 搭配使用比 ESI
和APCI 的应用范围更广一些。

 
 电喷雾电离源是一种软电离方式,即便是分子量大,稳定性差的化合物,也不会在电离过程中发生分解,它适合于分析极性强的大分子有机化合物,如蛋白质、肽、糖等。电喷雾电离源的最大特点是容易形成多电荷离子。这样,一个分子量为10000Da的分子若带有10个电荷,则其质荷比只有1000Da,进入了一般质谱仪可以分析的范围之内。根据这一特点,目前采用电喷雾电离,可以测量分子量在300000Da以上的蛋白质。电喷雾电离源是一种软电离方式,即便是分子量大,稳定性差的化合物,也不会在电离过程中发生分解,它适合于分析极性强的大分子有机化合物,如蛋白质、肽、糖等。电喷雾电离源的最大特点是容易形成多电荷离子。这样,一个分子量为10000Da的分子若带有10个电荷,则其质荷比只有1000Da,进入了一般质谱仪可以分析的范围之内。根据这一特点,目前采用电喷雾电离,可以测量分子量在300000Da以上的蛋白质。

   
大气压化学电离源主要用来分析中等极性的化合物。有些分析物由于结构和极性方面的原因,用ESI不能产生足够强的离子,可以采用APCI方式增加离子产率,可以认为APCI是ESI的补充。APCI主要产生的是单电荷离子,所以分析的化合物分子量一般小于1000Da。用这种电离源得到的质谱很少有碎片离子,主要是准分子离子。

APCI与ESI源都能分析许多样品,而且灵敏度相似,很难说出哪一种更合适。同时至今没有一个确切的准则判断何时使用某一种电离方式更好。但是通常认为电喷雾有利于分析生物大分子及其它分子量大的化合物,而APCI更适合于分析极性较小的化合物。

   
APCI源不能生成一系列多电荷离子,所以不适合分析生物大分子。而ESI源由于它能产生一系列的多电荷离子,特别适合于蛋白质,多肽类的生物分子。

ESI和APCI共同点:
1、使用高电压元件和雾化气喷雾法产生离子
2、通常产生(M+H)+或(M-H)-等准分子离子
3、产生极少的碎片,但可以控制产生结构碎片
4、非常灵敏的电离技术。
不同点:
1、生成离子的方式不同,ESI:液相离子化;APCI:气相离子化
2、样品兼容性
ESI:极性化合物和生物大分子
APCI:非极性,小分子化合物(相对ESI而言)且有一定挥发性
3、流速兼容性
ESI:0.001到1ml/min
APCI:0.2到2ml/min
4、ESI的适用范围要远远大于APCI

APCI优点∶
1.利用所得到[M+1]+及[M-1]–进行分子量确认
2.源参数调整简单,容易使用
3.耐受性好,喷雾器及针的位置不关键
4.LC流速可达2.0ml/min
5.好的灵敏度
缺点:
1.有限的结构信息
2.易发生热裂解
3.低质量时化学噪声大
4.不适合做分子量大于1000的化合物

傅立叶变换离子回旋共振质谱仪(FT-ICR MS)

我们知道FT-ICR
MS具有超高的分辨率和质量准确度,与其他质谱相比具有无与伦比的优势,但是其可控参数较多,调试比较复杂,要得到一副高质量的谱图,需要在仪器调试过程中下很大功夫,还需要对仪器的结构原理有较深入的了解。

以下是我在应用过程中的一些经验,我个人觉得以下几点很重要:

在调试过程必须要注意的几条规则:

1. 样品浓度要合适;

2.样品酸碱度要适当;

3.检测池中离子数目不能太多;

4.离子的能量要合适;

5.离子的累积时间并不是越长越好。

欢迎同行留言,相互交流!

网上在线免费化学物性、光谱和反应数据库

物性、质谱、晶体结构数据库
http://factrio.jst.go.jp/
简介:该数据库收录了有机化合物的物性、质谱、晶体结构等数据,数据主要取自LANGE' S HANDBOOK OF CHEMISTRY
12/e,J PHYS CHEM REF DATA
Vol.1,No.4,841-1009(1972)以及Sicherheitstechnische Kennzahlen
brennbarer Gase und Daempfe
2.Auflage。截至97年8月,热物理和热化学性质数据库Kelvin收录数据共有61,480条;质谱数据库Dalton收录15,526条以及晶体结构数据库Angstrom收录9,169条。用户经免费注册后即可以检索并下载所需要的数据,但是个人下载的总量不得超过数据库总量的10%。

 

通过精确质量确定元素组成:从四极杆到傅立叶变换离子回旋共振质谱仪

 
利用质谱测定元素组成的方法已被广泛应用于各种领域研究,如:药物研发、药物代谢、环境研究、法医、食品安全、香精香料、兴奋剂以及天然产物等。传统的观念认为,要测定元素组成,必须获得高质量精度;而高质量精度只能从高分辨率质谱获得,如:TOF,
Orbitrap 或者FT ICR MS。

 
最新的傅立叶变化离子回旋共振质谱仪(FT-ICR
MS),其质量分辨率达到800,000:1,通过它可以得到 200
ppb的质量精度。但即使在如此高的质量精度下,仍然会存在好几个候选的化学式,必须依靠我们去选择和推断。

 
而在飞行时间质谱(TOF)上,典型的质量精度约为 5 ppm,通常候选的化学式有5~10个,加大了选择和推断的难度。

 
而且不幸的是,在所有上述情况下,正确的结果往往不是质量误差最小的候选化学式。所以仅仅依靠精测质量一个条件,不可能得到唯一可靠的化学式。但这些有着非常近似质量的候选者,由于元素组成不同而产生了不同的同位素分布,这个特点可用于进一步区分它们。

 
过去,研究者通过调节峰的宽度,来模拟和假定一个同位素高斯分布,试图用这个高斯峰形来区分上述的差异。但由于候选者彼此间同位素分布的差异极小(通常只有几个百分点),所以过去的方法常常是失败的,除非化合物中存在特征元素如Cl和Br。

为了区分同位素分布之间的微小差异,发展了一种综合的、同时包括质荷比(m/z)校正和更为重要的、峰形校正的方法,可以获取高精度的谱图,从而得到唯一的、正确的元素组成。而且,在低分辨的四极杆或者三重四极杆类型质谱仪上,也可用这种校正方法来获得唯一的化学式。

实验:

  未知化合物(m/z=399
Da)和内标(m/z=410
Da,C28H60N+,精确质量410.4726
Da)混合,然后直接进样进入Waters Quattro三重四极杆质谱。用MassWorks软件进行质量轴和峰形的校正,得到1,517种可能的化学式。而排在第一位的C25H23N2OS+质谱准确度为99.44%。这个来自盲样分析样品的化学式在随后被合作者认为是正确的。

 
而同样的化合物,使用质量精度达到100 ppb的FT
ICR质谱,仅仅以质量精度为条件搜索,会得到5个候选化学式,排在第一位的仍然是争取的C25H23N2OS+结果。

结论:

 
虽然质量精度在确定元素组成时非常重要,但即使使用高分辨率的FTMS质谱,如果仅仅应用质量精度一个条件,我们仍不能确定唯一的化学式。另一方面,对轮廓模式采集的质谱进行正确校正,以正确的同位素轮廓为基础,我们得到新的度量参数——谱图精度,它使我们即使使用单位分辨率的质谱,也可以获得唯一的、正确的化学式。

 

 

长期以来,由于生物样品的非挥发性、热不稳定性以及分子量大等特征,质谱的应用仅局限于对小分子的分析。但上世纪80年代的两项电离技术的发明:基质辅助激光解吸附(MALDI)和电喷雾(ESI)技术,使这一情况发生了戏剧性变化,同时也促进了质谱仪器的巨大发展,包括新的质量分析器的研发和各种多级的复杂的仪器的设计和组合层出不穷,如混合型四极杆飞行时间质谱(Q-Q-ToF)、串联飞行时间质谱(ToF-ToF)、混合型离子阱傅利叶变换离子回旋共振质谱(IT-FTICR)、轨道回旋共振Orbitrap质谱等。如今的质谱不仅可以对生物分子进行简单的质量测定,还可以对其分子结构、修饰位点和修饰种类进行测定。

生物质谱仪通常包括三个部分:离子源、质量分析器和检测器。质量分析器是质谱的核心元件,决定着生物质谱的灵敏度、分辨率、质量准确度和生成大量信息的碎片离子谱图的能力。

目前在生物质谱领域有四种基本的质量分析器:飞行时间、四极杆、离子阱和傅利叶变换离子回旋共振、Orbitrap,它们的设计和性能不尽相同,各有其优点和劣势。这些分析器可以独立使用,也可以串联使用以发挥各自的优点。

1. 质谱仪器的种类

1.1 四极杆(Q)质谱仪

四极杆质谱仪的质量分析器是由四根棒状的电极组成,两对电极中间施加交变射频场,在一定射频电压与射频频率下,只允许一定质量的离子通过四极杆分析器而达到检测器。四极杆质谱仪的突出优点是仪器结构简单,体积小,没有磁铁作分析器,所以没有磁滞效应,扫描响应速度快。其缺点是分辨率比较低。

四极杆质谱仪有多种组合类型,早期主要是单级四极杆质谱仪,该仪器与ESI或APCI离子源联用可以对分析物进行定性和定量分析。单级四极杆质谱仪依靠选择离子监控(SIM)方式完成定量分析,但是单级四极杆不能进行真正意义上的串级质谱分析(MS/MS),只能通过源内裂解模式得到部分碎片离子而实现类似MS/MS的功能。

多级四极杆的发展使四极杆质谱具有了强大的分析功能,可以实现所有的MS/MS扫描方式,包括子离子扫描、母离子扫描、中性丢失扫描等。三级四极杆是目前普遍使用的四极杆质谱,第一级四极杆选母离子,第二级四极杆作为碰撞室对母离子进行碰撞解离,第三级四极杆作为质量分析器完成离子分析。三级四极杆采集到的MS/MS质谱图信息量大,并且较少发生重排反应,因而四极杆的质谱数据质量要高于离子阱串联质谱数据。

1.2飞行时间(ToF)质谱仪

对于飞行时间分析器,分析物的质荷比是根据分析物在真空飞行管中的飞行时间推算出的。飞行时间质谱的质量分析器由调制区、加速区、无场飞行空间和检测器等部分组成。样品分子电离以后,将离子加速并通过一个无场区,不同质量的离子具有不同的能量,通过无场区的飞行时间长短不同,可以依次被收集检测出来。早期的时间飞行质谱由于受飞行距离的限制,分辨率很低,近年来采用了一些调节离子飞行距离的离子光学系统和延迟技术,如各种离子反射透镜等,目前,飞行时间分析器的分辨率和质量精确度有了很大提高,一般的仪器的分辨率均可达到12000左右,质量准确度在经过严格的质量校正程序后可达到PPM级,而检测的离子质量范围达到几十万。

ToF质谱仪也经历了由单级向多级串联使用的发展历程。与四极杆质谱仪类似,单级ToF只具有简单的质量分析功能。不同的是,除了源内裂解外(当与MALDI联用时)离子在飞行过程中容易发生源后裂解(PSD)而产生亚稳离子,这种方式也能实现MS/MS分析的部分功能。ToF-ToF可能是目前应用最为广泛的质谱仪之一,其较快的图谱扫描速率(约100-200张图谱/秒)、高分辨率和高质量精确度极大地满足了

蛋白质组学研究中的各种需求。AB公司生产的ABI4700 MALDI
ToF-ToF是这类质谱仪器的代表,该仪器由MALDI离子源、两级ToF、高能碰撞池、离子反射镜及检测器等部分组成,离子在MALDI源中产生并被加速和聚焦,对于MS模式可以直接由线性检测器检测。MS/MS模式下,通过第一级ToF选择母离子进入高能碰撞池中碰碎,然后进入第二级ToF重新被加速并被分析。最近AB公司又推出了功能更加完善的ABI4800系统,可以看作是4700的升级产品。相对于ABI4700,ABI4800采用了垂直立式设计离子光路更长;另外,对靶系统和激光系统也进行了改进采用了与MALDI靶完全垂直的激光光路设计。

1.3 离子阱质谱仪

离子阱质谱仪是一种串联质谱仪,在分析前先将离子聚集储存,离子阱是该仪器的核心部分,既可以作为碰撞室,又可以作为质量分析器。传统的离子阱(三维离子阱,即3D离子阱)由三个双面电极围成一个离子捕集室(一个环形电极,两个端盖电极),在环形电极射频电压的作用下,离子聚集在捕集室中心运动,在端盖电极上加电压可以选择出不同共振频率的离子进入检测器,也可以选择只有一种离子留在捕集室中,再用高速惰性气体碰撞诱导解离产生子离子,进行串联分析。离子阱可以储存所有从离子源进入阱中的离子,因此灵敏度极高。但同时,随着阱内离子数目的增加,空间电荷效应以及其他电场效应会导致被测离子频率的偏移,从而影响测量的准确度和分辨率,这种问题可以通过自动增益控制(AGC)设置控制进入离子阱的离子数量得以部分解决。线性离子阱(即2D离子阱)在3D离子阱基础上对离子阱的设计作了改进,使2D离子阱具有更大的离子容量和扫描速度。由此可见,离子阱的构造决定了离子阱只是一种中低分辨率的质谱,离子阱的优势在于,它具有非常强的离子储存和选择功能(RF电压扫描)。

1.4 离子回旋共振(ICR)质谱仪

傅立叶变换离子回旋共振质谱(FTICRMS)是质谱中十分重要的一类仪器,它是根据离子在磁场中会进行回旋运动的特性设计的。FTICR是一种具有超高分辨率和质量准确度的质谱仪器,其核心部分是由超导磁体组成的强磁场,和置于磁场中的ICR盒组成。FTICR因有超导体存在,必须在液氦的温度和超高真空的真空系统下工作,因此对环境的要求非常高。Obitrap质谱仪器是目前世界上质量精确度最高的仪器,可以达到亚PPM级,其核心部分是一个具有离子储存功能的C-Trap和质量分析器Obitrap。Obitap分析器由一个纺锤状电极组成。离子在高压射频作用下从从C-Trap注入Obitrap,在Obitrap中离子在磁场的作用下围绕中央的纺锤状电极震荡旋转,同时产生轴向的镜像电流,通过傅立叶转换后获得离子的质谱信号。C-Trap
除了具有储存离子功能外,还能起到静息离子的作用,因此可以有效消除离子空间电荷效应。Obitrap质谱仪器与FTICR质谱相比可以获得更高的质量精确度和分辨率,但是却不需要超导磁场环境,维护起来也更方便。

1. 5 混合型质谱仪

Q-ToF是由四极杆质谱和飞行时间质谱组成的串联型质谱仪,因此无论是在MS或MS/MS模式下均具有较高的分辨率和质量精确度。在MS模式下,四极杆具有离子导向作用;在MS/MS模式下,四极杆具有质量分选功能,第一级四极杆对母离子进行选择,离子的碰撞解离则在第二级四极杆中进行。装有反射器的飞行时间(TOF)分析装置与四极杆垂直配置,在MS和MS/MS状态下均有质量分析功能。在进行MS/MS质谱实验时,第一级四极杆质谱选取单一离子并将它送入碰撞活化室与惰性气体发生碰撞并使母离子发生诱导裂解,碰撞活化室由六极杆组成,在工作状态下四极杆上仅有射频电位,因而所有离子均能通过碰撞活化室,到达垂直飞行时间质谱的加速器中,在推斥极的作用下,离子进入TOF-MS进行质量分离,仪器的最终检测器为高敏感性的微通道板。由于此仪器配以电喷雾电离源(ESI)和基质辅助激光电离源(MALDI),可以分别实现与高效液相色谱联用或直接进样。为适应研究的需要进一步提高分辨率,此仪器装有多级反射器(W型),由于多级反射,其分辨率可达20000(FWHM)左右,Q-Tof可以进行多种模式的质量检测,主要包括MS
Scan、TOF MS和TOF MS/ MS,这些模式同样可以用于负离子的检测。

 
 
 Q-IT,即由四极杆和离子阱组成的混合型质谱。

例如,美国应用生物系统公司研制的QTRAP就是这一类仪器的代表。该质谱仪是将三重四极杆质谱仪(QqQ)中的最后一级四极杆(Q3)改为线性离子阱(LIT)设计而成,并可以通过电喷雾(
ESI)和大气压化学电离(APCI)与HPLC 联用。其独特之处在于Q3
同时具有线性离子阱和传统四极杆的功能,且在离子阱模式下MS/MS的灵敏度比常规的三重四极杆型高出数十倍至数百倍,同时作为四极杆操作时保留传统三重四级杆型的扫描模式,可以选择子离子扫描(PROS),、母离子扫描(
PRES),、中性丢失扫描(NLS),以及多反应监测或选择反应监测(MRM 或SRM),并且使全扫描方式的灵敏度提高。同时克服传统3D
离子阱的一些缺点,如低质量截止现象(1/ 3
效应)、碰撞效率低和定量分析性能较差等。因此,QTRAP的这种设计方式不但提高灵敏度而且也增加信息量,兼有定性和定量分析的功能,而且增加多种扫描功能和IDA
( Information Dependant
Acquistion)等软件功能,使得QTRAP?型串联质谱仪很快在有机化合物结构分析、药物筛选及其代谢物定性及定量分析和蛋白分子研究等方面发挥独特作用。

QTRAP串联四极杆线性离子阱质谱仪
主要应用领域
1、该系统主要应用于药物开发、农药、兽药残留分析、有机化学、配位化学研究等有机小分子领域小分子药物代谢分析,在同一仪器上对代谢物进行快速定性鉴定和定量分析
表征合成药物、天然产物提取物等的结构,推测其断裂机理,并快速定量农/兽药残留定性和定量分析 食品/环境中毒物分析
遗传疾病的临床诊断分析等
2、该系统也可应用于蛋白质组学(多肽、蛋白及其它生物活性物质)的定性、定量研究
进行高通量的蛋白质鉴定和单个凝胶斑点的鉴定进行大量高丰度蛋白的体系中痕量的低丰度蛋白的鉴定
准确确定蛋白质翻译后修饰(如:磷酸化、糖基化、乙酰化等)的个数和位点 可自动进行de novo的测序
研究蛋白质的共价和非共价的相互作用 与疾病相关蛋白质(biomarker)的分析
仪器特点
   
  QTRAP
四级杆-线性离子阱质谱仪把串联四级杆-线性离子阱技术首次结合在一起,既保留了串联四极杆质谱仪的优点,如母离子扫描(PS)、中性丢失扫描(NL)、MRM定量功能,又克服了传统3D离子阱质谱仪诸如低质量截止点(1/3效应)、“空间电荷效应”、碰撞效率低、定量功能差缺点,并可以作为独立的两种仪器进行操作,是一台集优异定性与定量功能于一体,广泛用于蛋白质(组)研究、药物开发、药物代谢、残留分析、检验检疫等生物大分子和有机小分子领域的全能质谱仪
当Q3(第三极四级杆)作为串联四级杆使用时,QTRAP是一台标准串联四级杆质谱仪,保留诸如母离子扫描、中性丢失扫描等串联四极杆扫描功能,优异的多反应检测MRM定量功能,宽的动态线性范围,连同高能量的碎裂能力,在小分子研究领域,尤其是对天然药物、药物代谢和药物残留分析等,都具有单纯的离子阱质谱仪不可比拟的优越性
当Q3作为线性离子阱使用时,QTRAP保留传统三维离子阱质谱仪全扫描灵敏度高、分辨率好、多级碎裂(MS3)等优点,同时克服传统三维离子阱质谱仪的固有缺陷:质量歧视效应(1/3质量效应)、空间电荷效应(QTRAP空间扩大200倍)、定量线性范围差(QTRAP
6个数量级,三维离子阱
4个数量级)、质量准确度差等;QTRAP独有的增强性多电荷扫描(EMC)和时间延迟碎裂(TDF)功能,从不同方面降低噪音,简化图谱,降低数据信息解析的复杂性;QTRAP质谱仪的增强分辨率功能,可以准确确定离子的电荷状态,从而大大增加化合物鉴定的可靠性、区分结构相近的化合物和杂质;多种串联质谱模式和多级串联质谱功能,确保蛋白质修饰位点的准确确定
另外,QTRAP整机中采用了多项专利设计,可配置多种离子源和接口,具有灵敏度高、测量范围宽、选择性好等特点,同时为了满足化合物筛选和评价实验的需要。革新性的LINACTM线性加速碰撞室,有效消除记忆效应,使仪器的分析速度大大加快,在做MRM的同时,采集MS/MS数据,进行结构鉴定,即可以在一次进样过程中,同时实现定性、定量分析;专利高压聚焦Q0、Q2四极杆及预四极杆技术保证了100%的离子传输率,大大提高了灵敏度,只需极少量样品(fmol级)即能对化合物进行结构鉴定;专利‘气帘接口设计’既保证灵敏度又保持了抗污染能力,无需狭窄的毛细管设计,仪器不会堵、且不需经常清洗,同时无需加热的接口设计,防止了样品的降解;更新设计的离子源、内置分流阀、注射泵等,可进行快速而简便的操作等
QTRAP扫描功能
·     
  增强全扫描 (EMS):增加离子的利用率,便于微量分析
·     
  增强子离子扫描 (EPI):增加离子的利用率,便于微量分析
·     
  增强分辨率扫描 (ER):准确确定离子的电荷状态
·     
 
母离子扫描(PR):有效确定子离子和母离子间的关系,对化合物筛选、分类,有利于定性和断裂机理分析
·     
  中性丢失扫描
(NL)有效确定子离子和母离子间的关系,对化合物筛选、分类,有利于定性和断裂机理分析
·     
  增强多电荷扫描 (EMC),有效降低噪音水平,提高信噪比
·     
  时间延迟碎裂扫描 (TDF):简化图谱,有利于图谱解析
·     
  多级串联质谱功能 (MS3, add in-source dissociation,
actually MS4):结构信息丰富 多级串联质谱功能 (MS3, add in-source dissociation,
actually MS4):结构信息丰富
·     
  选择离子扫描 (SIM):用于经典的LC/MS定量分析
·     
  选择反应监测扫描 (SRM):用于经典的LC/MS/MS定量分析
·     
 
多反应监测扫描(MRM):可同时检测300对离子,用于样品中多组分的同时、快速、高通量定量分析
·     
  混合扫描 (Mixed Scan
Mode):一次进样完成上述所有扫描模式,获得更多信息正/负离子快速切换扫描 (切换时间 700ms
):便于进行化合物筛选和结构分析
QTRAP LC/MS/MS技术性能:
API离子源
·     
  配置TurbolonSpray (ESI)、Heated Nebulizer
(APCI)两种离子源
·     
  流速范围分别为2-1000ul/min和0.2-2.0ml/min
离子光学和四极杆质量分析器
·     
  专利碰撞聚焦四极杆Q0保证离子的最大传输率
·     
  专利线性加速碰撞LINAC技术可消除记忆效应,并提高灵敏度
检测系统
·     
  脉冲计数检测器可快速进行正/负离子检测方式切换
·     
  动态范围:1―4E6cps
真空系统
·     
  专利差分涡轮分子泵分流技术,空气冷却,无需维护
·     
  断电后自动关闭系统
数据处理和控制系统
·     
  Windows NT/2000界面 ,可自动进行数据实时和后处理
·     
  快速进行交替MS和CID/MS扫描
·     
  UV输入和LC控制
·     
  可控制不同厂家的9种LC泵,注射泵和自动进样器
·     
  可控制UV,荧光和ECD等检测器,与质谱仪同时采集数据
美国应用生物系统公司 4700 TOF/TOF蛋白质组分析系统
4700TOF/TOF蛋白质组分析系统是全球第一台TOF/TOF
串联飞行质谱仪,它作为目前的最新质谱技术,它一问世即被世界各大蛋白组研究中心和著名蛋白质实验室所争相采用。它由两级TOF和高能碰撞池组成,其工作原理是离子在MALDI源中产生并被加速和聚焦;对于MS/MS
模式可通过第一级TOF选择母离子进入高能碰撞池中碰碎,然后进入第二级TOF重新被加速并被分析。
回首ABI 3700
DNA快速测序仪给基因组学带来革命性的影响,4700蛋白质组分析仪必将给后基因组学的研究带来同样的革命性影响。4700
TOF/TOF系统现已成为蛋白组研究的最前沿核心工具。4700 MALDI
TOF/TOF质谱仪是全球第一台TOF/TOF串联飞行质谱仪,由两级TOF和高能碰撞池组成,其工作原理是离子在MALDI源中产生并被加速和聚焦;对于MS/MS模式可通过第一级TOF选择母离子进入高能碰撞池中碰碎,然后进入第二级TOF重新被加速并被分析。
·     
  独有分析所有蛋白质鉴定功能:分子量,PMF,翻译后修饰,序列测定,De-novo鉴定
·     
  独有高分辨功能,实现高分辨蛋白质组分析
·     
  高灵敏度,可鉴定低丰度蛋白
·     
  超宽质量范围: 400,000m/z
·     
  高通量分析速度比传统速度快10-100倍
·     
  高质量精准度
·     
  高能CID可提供大量结构信息,增强蛋白质鉴定的可靠性
LTQ-FT液质联用串联质谱仪:
LTQ-FT质谱仪由Thermo
Finnigan生产,将当前最先进的离子阱技术和傅立叶变换离子回旋加速器共振技术相结合,具有空前的分析能力和分析多样性。在液质联用的工作状态下,能得到超高分辨率、精确质量数和多级质谱分析数据,是进行代谢研究、蛋白质组分析、药物开发及其他研究最强有力的工具。
·     
  利用外标校准可达到好于2ppm的质量精确度
·     
  高分辨率,适合混合物分析
·     
  最大分辩率超过500,000(FWHM)
·     
 
系统中ECD和IRMPD裂解源可以得到和CID裂解源相补充的碎片离子,降低假阳性率和提高可信度,并可以从Top Down
的方法进行蛋白质分析。
·     
  ECD和IRMPD裂解源也是翻译后修饰(PTM) 未知肽序列测定(De
Novo)研究的重要工具
LTQ线性离子阱液质联用质谱仪:
LTQ线性离子阱液质联用质谱仪主要应用于蛋白质组学研究,如蛋白鉴定和差别表达的定量分析、生物标记分析研究、翻译后修饰研究等。LTQ的新型离子源、高效离子传输透镜、分段的线性离子阱、双检测器和先进的电子元件,使得LTQ具备优异的离子捕获能力和检测效率。线性离子阱储存率的增加,以及新的离子排出和检测方式,使其具有超高的分析能力,是灵敏度最高的LC/MSn多级串连液相色谱质谱联用仪之一。
LCQ液质联用质谱仪Deca plus XP:
LCQ液质联用质谱仪Deca plus XP是标准的离子阱质谱仪。
·     
  离子源设计及Ion
Sweep离子气体为复杂机制中混合物的分析提供了优异的稳定性,并且提高了全扫描灵敏度。
·     
  全自动的MSn功能及先进的Data Dependent扫描功能能快速得到数据结果。
·     
 
功能强大的Xcalibur软件可促进数据分析,简化结果生成,从而提供了一个能加速研究和开发的高通量平台。
Q-TOF液质联用质谱仪:
Q-TOF
Micro台式高分辨串联质谱仪由英国Micromass公司(现美国Waters公司)生产。
·     
  专利的Zspray接口-双正交取样技术,提供最佳灵敏度和耐用性
·     
 
专利的Lockspray技术保证精确质量测定-MS和MS/MS模式下质量准度优于5ppm
·     
  高分辩率:5000FWHM
·     
  增强的线性动态范围满足定量分析要求
·     
  正交加速飞行时间分析器:m/z可达到20,000Da
·     
  数据直接分析DDA技术,对感兴趣的化合物可自动进行MS及MS/MS切换操作
·     
  可变流速色谱技术:Waters CapLC毛细管液相与Q-Tof
MicroTM联用,大大改善MS/MS数据质量

 

 

现在主流的质谱技术是大气压化学电离质谱(API),包括APCI, ESI,
APPI等,由于这些电离的技术比较新,相关的专著比较少。我看到一些书仅是简单的介绍了这些API的接口,很少有对这些接口下的裂解进行探讨的,而这样的研究现在主要来源于几本质谱学的杂志(RCM,JMS,
JAMSS)。以API源作为接口的质谱,现在主要有离子阱,三重四级杆,TOF,LTQ等。离子阱有多级质谱(MSn)功能,是结构研究的强有力工具,LTQ(线形离子阱)也可以实现类似的功能,但现在这种仪器还不普及。我以后说的解析主要是针对离子阱质谱的!

关于离子阱质谱最好的书是Raymond E. March 和John F. J.
Todd的Quadrupole Ion Trap Mass Spectrometry-Second
Edition,这本书是讲离子阱理论最权威的了,只是里面太多的理论,当然学学这些对我们解析质谱还是很有帮助的,但假如没有很好的物理和数学基础,想看懂还是比较费尽的。


液相与质谱联用以后,与联用前比,增加的主要功能有哪些?液质在中药分析中哪方面应用最多?


你可以把质谱理解为一个检测器,就如常用的紫外检测器一样。

那我们想想,紫外检测器能提供什么信号呢?紫外检测器只能对那些在紫外区(一般为190-400
nm)有吸收的化合物有信号,也就是可以看到高出本底的色谱峰。这时候的信号仅能提供化合物相对量或者绝对量(需要标准物质)的信息,假如单波长紫外检测器改为DAD,那么这时候除了提供被分析物质量的信息以外,还能提供化合物的定性信息(特征吸收峰)。但DAD的紫外图谱作为定性的依据存在专署性差的问题(很明显,一张紫外图谱一般只有几个峰,并且都是很宽的峰,表示的信息当然很有限了)。

那么质谱作为检测器能提供什么信息?

1、定量信息
2、定性信息

下面我们具体分析一下,从定量和定性两方面质谱到底优于紫外的有哪些地方:
首先说定量,
(1)从可分析的化合物方面,质谱大大超过UV,比如没有紫外吸收或仅有末端吸收的化合物(皂甙、萜类、糖等),用质谱分析具有很大的优势。一般只要化合物能够被电离,就可以被分析。极性比较大的化合物可用ESI源,极性比较小的用APCI源,而对于那些极性非常小的化合物,比如多环芳烃类化合物,即便用APCI相应也很差,可以考虑用APPI。
(2)从灵敏度上看,一般质谱比紫外高1-2个数量级,假如采用SRM模式,灵敏度会更高,我们测过的生物样品最低可测到pg/mL(麦角甾酮类化合物)。
(3)从分析的速度和样品的通量上看,假如你用HPLC-UV作定量的话,必须把要分析的化合物与其他所有干扰物质分开,这个问题在分析体内样品的时候尤其严重。而用质谱的话,大部分情况你根本不用考虑分离,就可以实现定量,我们以前做的许多生物利用度的项目的分析方法都是死时间出峰的(Rt~=2
min)。这样的分析速度,我们每天可以测定大于200个样本,这时单纯的液相方法无法比拟的。
(4)当然还有其它更多的指标,这和不同厂家的仪器也有关,以后我们再详细探讨。

 

接下来再看看定性方面,我们以离子阱为例(定性是离子阱的强项):
(1)提供整个结构的信息。相对于DAD仅提供官能团的信息,质谱提供的信息丰富多了,尤其是多极质谱。有时候我们仅通过质谱就可以确定为之化合物的结构,给你一篇最新参考文献(Rapid
Commun. Mass Spectrom. 2006; 20: 2328-2342)
(2)辅助代谢产物鉴定,这方面也是质谱应用很广的一个领域。生物体内的代谢产物,往往很微量,直接分离得到相当困难,假如没有质谱技术,现在代谢物的鉴定将会是非常困难的。一方面质谱可以提供代谢物的碎片信息,辅助你推断代谢物的结构,然后你可以通过微生物转化或者合成的方法,得到代谢,从而最终确定代谢产物的结构;另一方面,也可以通过质谱直接确定代谢产物的结构,比如一些二相代谢产物(葡萄糖醛酸结合物等)。
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液质在中药方面的应用主要(国外文献)是集中在药材的基础研究上,比如使用多种质谱技术快速鉴定中药中的已知和未知化合物,而不需要像传统的方法那样进行植化分离,大大节省了成本和时间。

发了这么长时间,也没有人说个具体的问题,都是我在自己玩。可能作质谱的人比较少吧,搞研究的更少了吧,汗~~~~

质谱的解析关键在于要有想象力,你看别人的文章后,往往有种感觉,为什么自己没有想到呢?假如你能想到,那你也可以发文章了。

明天我把刚做的一个样品的图谱放上来,让大家练习一下,解析的比较好的,还请斑竹多多鼓励。


刚才又看了上面发的那个生物碱解析的例子,不知道大家有没有人仔细看过,有没有看懂了?

上面解析的就没有问题吗?是不是还有别的可能?

还有最基本的,不知道大家会不会看多级质谱?那些标记代表什么意思?原始的图谱是怎样表示的,而写文章的时候又需要怎样表示?

 

我对质谱解析不怎么懂
但是看楼主在上面分析裂解规律的时候我想有些质谱反应就是分子内的有机反应,想请教楼主在学这一块知识时是不是应该相应补充一些高等有机的知识?

 

一般分子的碎裂反应发生在高真空中,可以看成单分子的裂解反应;当然在离子阱中,离子浓度比较高的时候,还可以观测到双分子的反应。所以在解析质谱的时候,若遇到不能解释的情况,可以考虑是不是发生了双分子的反应。

做硕士时,我发现几个化合物的二级质谱图上可以观测到比母离子大14
Da的离子,当时很是奇怪,难道一个分子越碎裂质荷比越大吗?还是这是个干扰离子呢?经文献检索,也没有发现离子阱中可以生成这样的离子,并且只有含有羧基的化合物才会有这种反常的现象,在我们测试几个其它含有羧基的化合物中,大部分化合物观测到了这样的现象,但也有的化合物由于更易发生其它形式的裂解反应,没有观测到加14
Da的离子。

初步推测这种奇怪的现象可能与羧基有关!这些羧基化合物在正离子模式下,非常容易发生脱水反应(羟基上发生质子化),生成酰基正离子!另外我们发现生成的酰基正离子是与加14Da的离子经常共存,它们之间相差32Da,这提示我们可能是酰基正离子与溶剂中的甲醇反应,即分子离子反应!!

有了这个假设,剩下的只要设计实验证明就可以了。我们采用一个很简单的实验进行了证明,将样品溶解在乙醇中,然后再进行质谱分析,这时我们在化合物的二级质谱图中观测到了加2a的离子,也就是酰基正离子与乙醇发生了反应,这样的结果正好证明了我们前面的推测。


有机化学我以前很感兴趣,考研的时候看了很多高等有机的内容,也许这个对解析有点作用。我的经验是,解析是个综合性的过程,需要多面的知识,更需要经验,要不断地去尝试,去与有经验的人交流。


这是我刚做的一个化合物,给出了结构和多极图谱,希望各位联系一下,对图谱中的碎片进行归属


确定所研究中药的原植物来源,尽可能把该植物已知的化学成分的结构、质谱数据、UV数据收集完全。必要时收集整个属的化学成分的相关数据。

2进行LC-MS正负离子切换一级质谱检测。目的:确定分子量。仅靠一种离子模式检测确定分子量并不是很可靠,除非在正离子模式下同时观察到[M+H]+,[M+Na],[M+K]+峰。根据依次相差22,16可以确定分子量。

3结合DAD所得紫外图谱特征,确定化合物大概类型。

4进行多级质谱检测,根据裂解碎片,确定分子中可能含有的碎片,结合分子量和生源,如果是已知化合物的话,至此基本可以归属化合物。当然,立体异构体还无法归属。比如苷中糖的连接位置,甲基的取代位置还是很难确定的。

5如果能做LC-TOF-MS,或者其它高分辨率MS,得到分子式的话就更好了。

6必要的时候对于立体异构体采用反应质谱法试一试。

7根据初步鉴定结果,购买可能的化合物标准品,进行对照实验。

一点感想:
1我国的液质仪器目前肯定是不少了,但是充分发挥作用的还是少数。许多仅仅用来定量,有的甚至仅仅摆放着。
2离子阱质谱比较便宜,而且能做到10级左右,非常适合结构研究。
3可惜的是目前关于负离子裂解规律,以及离子阱质谱中裂解反应的规律认识还不够。不像EI,早已可以进行计算机辅助鉴定,软电离质谱目前缺乏标准数据库,对于结构确定来说是个困难。
4液质毕竟还是比较昂贵的仪器,通常有专人管理,所以利用者通常不是操作者,再加上国人合作精神差,所以常常不能发挥仪器的潜力。


1、“逆DA裂解”,我想你已经指的是RDA裂解,假如是的话,直接用RDA表示更符合习惯些;
2、从m/z 378-- 335, 失去了43
Da的碎片,我们注意到这是一个奇数碎片,有可能是含氮的中性碎片,也有可能是含有自由基的碎片。scvkeful认为丢失了一个自由基CH2=CH-O,假如丢失的是这样的自由基,那么需要断裂连个C-C键和一个C-O键,而对于C-O键断裂所需的能量是非常高的,而从图中我们可以看到从m/z
378-- 335仅需要
25%的能量,这是非常小的能量,也就是说这样的碎裂是非常容易发生的,因此这样的碎裂过程涉及的肯定不是能垒较高的自由基反应,而是中性丢失反应。
3、一些表示方法的错误,按照S版主的解释,m/z 335应为自由基,但是没有标示出来;m/z 213和m/z
198的碎片,又把已经失去的自由基CH2=CH-O多画上了;失去甲基自由基的碎片也应该标上自由基(m/z 198);m/z
213和m/z 198应该标示出正电荷位置。

一点感想:
1我国的液质仪器目前肯定是不少了,但是充分发挥作用的还是少数。许多仅仅用来定量,有的甚至仅仅摆放着。
2离子阱质谱比较便宜,而且能做到10级左右,非常适合结构研究。
3可惜的是目前关于负离子裂解规律,以及离子阱质谱中裂解反应的规律认识还不够。不像EI,早已可以进行计算机辅助鉴定,软电离质谱目前缺乏标准数据库,对于结构确定来说是个困难。
4液质毕竟还是比较昂贵的仪器,通常有专人管理,所以利用者通常不是操作者,再加上国人合作精神差,所以常常不能发挥仪器的潜力。

同感!
1、不同型号的质谱有不同的优势,比如离子阱、TOF、FT-ICR的主要优点是定性,让它们作定量,效果肯定不如Q-Q-Q;反之亦然。
2、离子阱的理论是可以做到10级,但根据化合物的不同,有些做到3-4级以后,很多就没有信号了;现在我还没有遇到可以做到10级的化合物。
3、软电离质谱的一个最大缺点(也是优点)就是裂解能量不固定,不同厂家仪器,不同试验时间的重复性差;但其涉及的裂解规律应该比EI简单的多,主要为中性丢失反应,而为什么大家说难呢,一方面是前面说的原因,还有一个就是xubeibei提到的负离子谱。
现在已经有了一些技术可以控制谱图的重现性,估计ESI谱图库的出现不会太远了!
4、这个不是技术问题啦,呵呵。


你对新知识的渴求和用于探索的精神还是很值得我们学习的,比那些不敢尝试的人强多了。根据我自己的理解,对你的解析提出一些建议,不当之处还请海涵。

1、“逆DA裂解”,我想你已经指的是RDA裂解,假如是的话,直接用RDA表示更符合习惯些;
2、从m/z 378-- 335, 失去了43
Da的碎片,我们注意到这是一个奇数碎片,有可能是含氮的中性碎片,也有可能是含有自由基的碎片。scvkeful认为丢失了一个自由基CH2=CH-O,假如丢失的是这样的自由基,那么需要断裂连个C-C键和一个C-O键,而对于C-O键断裂所需的能量是非常高的,而从图中我们可以看到从m/z
378-- 335仅需要
25%的能量,这是非常小的能量,也就是说这样的碎裂是非常容易发生的,因此这样的碎裂过程涉及的肯定不是能垒较高的自由基反应,而是中性丢失反应。
3、一些表示方法的错误,按照S版主的解释,m/z 335应为自由基,但是没有标示出来;m/z 213和m/z
198的碎片,又把已经失去的自由基CH2=CH-O多画上了;失去甲基自由基的碎片也应该标上自由基(m/z 198);m/z
213和m/z 198应该标示出正电荷位置。
下面附上我自己的解析,望大家多多批评:

cooks兄的讲解挺有道理,我对这块的确是个新手,只是以前有过分析化学中ei解谱的基础,所以昨天大胆的在这里瞎闹
cooks兄耐心的指点也让我感觉你谦虚纯朴的学风,以后如果遇到这方面的问题肯定继续向你请教


楼主的帖子讲的很有道理,LC-MS作定性我没试过,想请教楼主对于样品中的杂质,如果ESI响应一般,要用LC-MS作结构解析含量至少要多高,比如0.01%能做吗(假设溶液浓度是10mg/ml)?


mingzuo wrote:
楼主的帖子讲的很有道理,LC-MS作定性我没试过,想请教楼主对于样品中的杂质,如果ESI响应一般,要用LC-MS作结构解析含量至少要多高,比如0.01%能做吗(假设溶液浓度是10mg/ml)?

这个具体的量根据化合物而异,只要这个化合物的响应足够得到化合物的多级质谱就可以了。你说的0.01%或者更低,都有可能采集到多级质谱信号。

但我们需要明白,一个未知化合物能不能最终鉴定结构,有时候仅仅是通过多级质谱还是不够的。你可以把你的样品信息贴上来,给你具体分析一下。


质谱解析关键在于多练习,孰能生巧。

下面是这几天刚做的一个样品,大家先练练手。

(缩略图,点击图片链接看原图)


anastrozole这个化合物的结构中存在对称,它在MSn主要发生失去苯环的周边基团的反应,它的多级质谱关键是MS3,只要弄清了MS3中主要碎片之间的关系,所有的图谱就一通百通了。下图指出了这些碎片间可能存在的关系:


根据上图所指明的关系,我们可以得到这个化合物的所有主要碎片的解析:

(缩略图,点击图片链接看原图)


请问有没有碰到过,出现M+H 峰的同时还有M+H+2 峰的情况?这个M+H+2 峰 是什么?







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