PriCells: 藻红蛋白标记抗体的方法﹠PE标记蛋白A方法

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所属分类:蛋白质修饰

藻红蛋白标记抗体的方法:

1. 巯基化藻红蛋白(PE)的制备;

(1)将600μl浓度为15.5mg/ml的盐酸巯醇亚胺加到1.2ml浓度为3.6mg/ml的PE中;

(2)将以上混合液和1.2ml pH6.8的PB混合,而后装入透析袋置入50mmol/L pH6.8的PB中于4℃透析,过夜;

(3)再换用pH7.5 PB透析6h。每个PE分子中可结合8个巯基;

2. 巯基PE-IgG的制备;

(1)将30μl浓度为1.1mg/ml的异双功能试剂SPDP的乙醇溶液,加入到700μl的4.2mg/ml IgG PB溶液(50 mmol/L pH7.5),在室温中反应2.5h;

(2)再将400μl浓度为1.7mg/ml的巯基化PE加到500μl反应混合液中,室温反应12h;

(3)加入50 mmol/L的碘乙酸钠100μl来封闭残余巯基,于4℃下用PB透析过夜;

(4)最后加入0.01%的Na3 N3 后分装,于4℃保存半年;

PE- 标记蛋白A方法:

1. 称取4.08mg PE溶于1ml浓度为0.1mmol/ml pH7.4的PBS中,溶解后,取出0.5ml,再加入浓度为2.65mg/ml的SPDP无水甲醇液10μl,SPDP/蛋白质物质的量比为10,22℃反应5min,过Sephadex G-50(1×17cm),用100mmol/L pH7.4的PBS平衡和洗脱;

2. 将0.5ml浓度为2mg/ml的蛋白质和100mmol/L pH7.4的PBS液混合,把2.6μl上述SPDP甲醇液加入混合液中,使得SPDP:蛋白质=9:5,于22℃下放置40min后,再加如25μl pH7.4的二硫苏糖醇(DTT)缓冲液,于22℃下反应25min后,过Sephadex G-50,收集蛋白A峰;

3. 将0.77mg/ml的PE和0.27mg/ml蛋白A等量混合,于22℃下反应6h后,将混合物于4℃保存备用;

4. 将以上两种PE标记制品溶于0.01mol/L pH7.4 PB(含有0.1mol/L DETA、1mol/L 碘乙酰胺、1%BSA和0.1% NaN3 )中,于0—4℃保存;

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