基于质谱的蛋白质鉴定,第1节:蛋白质鉴定技术简介

  • A+
所属分类:蛋白质鉴定

蛋白质组学(Proteomics)的分析一般可分为四类分析方法:(i)快速而简单的分析方法,用于从复杂混合物中纯化少量蛋白质;(ii)快速而灵敏的方法,可从目标蛋白质中获取少量但足够的结构信息 (iii)获取拓展的蛋白质或DNA序列数据库,以及(iv)能够通过计算机算法将DNA序列信息与各种类型的蛋白质结构信息结合起来,例如N末端蛋白质或内部肽序列,氨基酸组成,肽质量指纹图,MS片段图谱或所选肽的序列标签。

高分辨率凝胶电泳(2-D凝胶电泳是目前最有效的蛋白质分离方法),自70年代后期就已经被用作分析工具。但一直到蛋白质样品制备方法和测序工具得到了相当大的改进之后,二维凝胶电泳才发展成为制备性的蛋白质纯化程序。蛋白质能够通过电印迹法转到化学惰性的膜上,可能是蛋白质微量样品制备中最重要的步骤之一,因为它将高分辨率凝胶电泳(纯化步骤)和气体色谱(分析步骤)直接联系在了一起。电印迹法又可以结合基于膜的埃德曼化学法形成N末端或内部肽序列。这种组合技术现在通常称为微测序,因为与早期技术相比,它使样品制备的灵敏度提高了至少100倍,从而可以分析低至pmole或μg级别的蛋白质。这项技术在80年代后期开始流行,当时聚二氟乙烯(PVDF)印迹膜已经成功商业化。同一时期,第一个2-D凝胶蛋白序列数据库(实际蛋白质组学的祖先)也诞生了。但是,由于当时已知的蛋白质或DNA序列数量很少,这些数据库中的信息非常有限。因此,微测序法更常被用作cDNA克隆的起始点,而不是用于通过同源性进行蛋白质鉴定

随着蛋白质,DNA和表达序列标签(EST)等数据库信息在90年代以来的迅速增长。从头测序变得不再那么常见,而重测序或通过比较法进行测序变得更加重要。这是生物质谱(MS)技术进入测序领域的正确时机。质谱MS是非常快速灵敏的技术方法,即使到了现在,MS技术的分析速度和灵敏度仍未达到其极限。MS技术的两大主要领域是:基质辅助激光解吸电离/飞行时间(MALDI-TOF)质谱和电喷雾电离(ESI)质谱,这两种方法的区别在于其电离分析物的方法,相关的样品制备程序也不同。因此ESI主要与液相色谱仪器相结合,而MALDI-TOF更适合于高通量检测,更适合于大规模的蛋白质组学分析。随着快速蛋白质鉴定技术的发展,对高度可重复的,可比较的,大规模二维凝胶电泳方法的需求稳步增长,也通过引入可固定的pH梯度法得以实现。 

最后,还需要将所有的数据结合起来。氨基酸序列,肽质量指纹或肽MS片段数据需要被翻译为带注释或无注释基因组序列数据库中的DNA序列。每个DNA序列可以从两端和三个不同的开放阅读框进行读取。在某些表达序列标签(EST)中,经常会出现错误,使得搜索变得困难。而计算机算法可以成功地解决遇到的这些挑战,可以匹配到最接近MS分析获取的结构信息对应的蛋白质或DNA序列片段。

基于质谱的蛋白质鉴定系列总结,将主要集中在两个部分:(i)如何从凝胶纯化的蛋白质样品中获得必要的结构信息,(ii)以及如何使用此类信息鉴定蛋白质。第2节简要介绍了基于常规Edman的N末端或内部肽测序的方法。 在第二部分中,我们重点介绍基于MALDI-TOF的蛋白质分析方法,并简要回顾将MS生成的数据与数据库中存储的序列进行匹配的算法。

本文由百泰派克生物科技整理编辑。

北京百泰派克公司采用高分辨率质谱平台技术,包括Thermo Fisher的Q Exactive质谱仪,LTQ Orbitrap Velos质谱仪,以及AB SCIEX的6500 Q TRAP质谱仪,结合 Nano-LC高通量液相色谱技术,能够对SDS-PAGE蛋白条带、2D蛋白胶点等样品中的蛋白质进行高效精准鉴定。胶条、胶点蛋白质谱鉴定服务可保证100%的鉴定率,否则不收任何费用。

文献参考:Protein identification methods in proteomics. Electrophoresis, 2000.







  • 蛋白质组学业务咨询
  • 扫码咨询相关问题
  • weinxin
  • 代谢组学业务咨询
  • 扫码咨询相关问题
  • weinxin

发表评论

:?: :razz: :sad: :evil: :!: :smile: :oops: :grin: :eek: :shock: :???: :cool: :lol: :mad: :twisted: :roll: :wink: :idea: :arrow: :neutral: :cry: :mrgreen: