综述 | 关于报告代谢物数据的建议

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所属分类:代谢组学

本文由fufu编译,董小橙、江舜尧编辑。

原创微文,欢迎转载。

导读

在过去的十年中,我们在测定越来越广泛的代谢物方面取得了巨大的进步。尽管转录组学方法提供了几乎完整的覆盖范围以及蛋白质组学方法现在能够检测超过45%的细胞蛋白补体,但代谢组学目前只能确定细胞中发现的小部分代谢物。据估计,整个植物界至少有20万种不同的代谢物,在一个单独的物种中有7000到15000种代谢物。然而迄今为止,即使是最全面的方法也只能检测到1000到2000个被表明是植物组织中合成的真实化学实体的分子特征。代谢物的化学多样性及其在细胞丰度上的广泛动态范围使得代谢物的测量更加复杂。由于代谢物分析的目的和方法的各不相同会产生许多潜在的错误或误解,确定获取和报告代谢物数据的指南尤为重要。本文的目的是强调潜在的误差来源,并提供建议以确保获得和报告的代谢物数据的稳健性。我们的建议包括以下几个方面:代谢物的取样、提取和储存方法、代谢物的鉴定、大数量样本的处理、代谢物鉴定方法和代谢物定量的确定性水平的报告。

论文ID

原名:Recommendations for Reporting Metabolite Data

译名:关于报告代谢物数据的建议

期刊:The Plant Cell 

IF:9.378

发表时间:2011.7

第一作者:Alisdair R. Fernie

作者单位:马克斯-普朗克研究所

综述内容

1 代谢物的取样、提取和储存方法

大多数代谢物可以放置在液态氮中随后在恒定-80°C中储存。对于大体积组织的提取和极高周转率代谢物的测定,则需要使用更快速的猝灭代谢的方法,如冷冻夹紧法(将组织在两个预冻金属块之间大力压扁)。不管采用哪种淬冷方法,同样重要的是要避免处理过程中可能导致目标代谢物在处理后几秒或处理前几秒的变化。在某些情况下,组织处理可以从根本上改变某些反映生物学特性的代谢物。

样品在提取前和提取后均应以适当的方式保存。对许多代谢分析来说,储存的最佳方法是去除水溶剂或有机溶剂,随后生成干燥的残留物。冷冻样品应尽可能快地处理,避免在液氮中储存数周或数月。值得注意的是,挥发性或半挥发性代谢物应在新鲜原料上进行分析,不适用于上述方法。

在整个研究期间需要标准化原料(一些研究可延长至数月甚至数年),化学定义的可重复的标准混合物或标准化生物参考样品应与样品一起存储。

重复

另一个重要问题是生物、技术和分析重复的性质和数量。生物重复通常是来自同一基因型的在相同的条件下生长的独立来源。技术重复涉及完整分析过程的独立执行,而不是重复注入相同的样品(也就是分析重复)。虽然分析重复在评估机器性能方面很有用,但是包含整个实验过程的技术重复能对数据生成中的实验方差进行更全面的评估。生物重复比技术重复重要得多,至少应设置三个或者三个以上重复。是否需要技术重复在很大程度上取决于所采用的分析方法的精确度。在技术变异明显低于生物变异的情况下,明智的做法是牺牲技术重复来增加生物重复的数量。

在整个生物实验、样品制备工作流程和仪器分析过程中,对生物重复进行仔细的时空随机化以最小化不受控制的影响是一种必不可少但尚未普遍采用的做法。简单有效的样本随机化方法是随机分组设计,它同样适用于现场试验、样品处理和仪器分析,因此强烈建议在大规模实验中采用这种方法。

仪器性能和数据质量

代谢组学的另一个主要问题是在没有任何信息来评估仪器性能或数据质量的情况下发布数据集。缺少仪器性能测试并进行报告可能导致大量低质量数据集的公布,这些数据集会被仪器性能所影响(例如,缺失或低信噪比峰值)。这些问题可以通过对全球标准阳性对照样品的常规分析来改善,从而验证预期的相关代谢物的灵敏检测是否令人满意。

在选择对照样品时,这些样品可以是确定浓度的真实代谢物标准的混合物。然而一种广泛共享的、具有良好特性的全球标准生物提取物的干储存量可能是最有用的参考,因为它们将为许多结构未知或标准难以获得的代谢物提供一个定量的全球参考。这种做法将有效改进数据评估方法和建立客观的最低质量指标,并使不同数据集之间进行更有意义的定量比较,充分提高新兴植物代谢表型数据库的效用。

2 代谢物的鉴定

对于代谢物的鉴定,核磁共振(NMR)代表了结构鉴定的黄金标准。NMR是高度可复制的,这很大程度上是因为其依赖于纯物理标准,通过仪器描述、配置、提取类型和数据采集参数以及光谱数据的输出足以使代谢产物的定义明确无误。即使是核磁共振也可能产生模糊的识别,最终可能需要全合成、x射线色谱和能够确定绝对立体化学的方法来定义代谢产物。联用质谱法(MS)(如气相色谱[GC]-MS和液相色谱[LC]-MS)的鉴定可能更加模糊,因为色谱分离和随后的质谱测定往往无法区分高度相关的代谢物或准确的化学异构体,而这些异构体往往存在于生物材料中。采用GC-MS时需要所使用的衍生化化学的有关信息。采用LC-MS和毛细管电泳(CE)-MS技术时应注意改善离子抑制的问题。GC-MS、LC-MS、CE-MS或傅里叶变换-离子回旋共振质谱的鉴定依据必须要有文件证明。

代谢物的鉴定应该考虑的具体标准是:(1)根据与真实标准的比较进行标注;(2)如果没有可靠的标准(通常是难以纯化或合成昂贵的次生代谢物的情况),代谢物特性和类别与公开可用的数据库或图书馆匹配;(3)在MS准确的情况下,可以推导出求和公式的最佳命中值从而获取MSn数据并用于识别或支持所提出的结构假设;(4)用于代谢物测定的高效液相色谱(HPLC UV/Vis)系统应证明提取物具有足够的纯度以保证能够实现在波长最大值下精确定量所需的光谱质量和色谱的分离度;(5 )基于酶的代谢物测定在首次应用时应得到充分证据证明其对所讨论代谢物具有特异性。

应用:大量基因型的代谢组学

小规模实验的质量控制在涉及大量遗传变异的实验中相对容易,如重组自交系、渐渗杂交系或生态型库或品种库的分析等。在番茄方面的研究进展得益于包括代谢重组实验的优化研究。在最近的研究中,每台机器运行时都注入由从对照基因型制备的主混合物的等分试样能获得更好的数据质量。鉴于绝大多数代谢组学方法提供的是相对水平而不是绝对水平,因此强烈建议在大规模生物实验中采用类似的方法。对于转化生物学来说,进行经验试验来优化有关组织的方法是非常重要的。例如,在最近的一项调查中,我们测定了番茄和水稻中衣原体和其次生代谢产物中Calvin-Benson循环中间体的潜在缺陷。在进行大规模筛选之前,这些初步实验是必不可少的。

3 代谢物的量化

虽然许多代谢物数据目前是作为相对值来表示的,但下面的几点同样适用于绝对量化产生的数据:(1)要确保所测得的代谢物水平都在其线性检测范围之内;(2)不完全破坏组织是在代谢物谱工作流程中产生变异的主要来源之一,因此在提取过程中确保组织完全被破坏是非常重要的;(3)可通过提取、储存和测量过程来评价代谢物的稳定性。进行回收实验可以识别到产生问题的步骤,从而优化此阶段以减轻或至少最小化问题,同时回收实验可以通过交叉检查是否有足够的生物和技术重复数量;(4)在组织特征不明显的情况下,检出限、鉴别限和定量限也很有用,特别是用于估计提取物中关键代谢物类别。

应用:回收实验

回收实验可以提供有说服力的证据,表明报告的数据有效地反映了细胞代谢物的组成。但是代谢组学中采用这种方法较少,因为这种实验仅可用商业上可获得或者易于化学合成的化合物,并且代谢组学研究中的大多数代谢物没有可用的标准,因为对于未知化合物来说这种方法是不可取的。目前产生了一种新的替代方法,也就是将新研究出的植物组织与之前已经很好地表征的植物组织相结合,我们建议对于已知的代谢物,研究中的每种新组织/物种类型都应该进行回收或代谢重组实验。对于回收和代谢重组实验,在技术重复的数量是足够的情况下,回收率在80-120%之间是可以接受的(超过100%的值是生物材料和分析程序的简单方差结果)。任何超出这个范围的代谢物其定量被认为是有问题的或不可靠的。

4 实验的记录

任何首次报道某一特定方案在新物种或组织类型上的应用的研究和显示显著改变的化学类的基因型或环境或生理治疗基因型表现出显著改变的研究,如果其使用概要分析方法,这些研究应进行这样的实验并记录它们的结果。一种明显的替代途径是开发某些代谢物的靶向方案,最佳的方案将取决于实验、生物材料、分析平台以及正在研究的代谢产物的种类,并且在完美性和实用性之间始终存在平衡。

应用:以前未特征代谢物的组织分布

代谢组学的另一个有趣的方面是可以发现新的化合物并阐明它们的生物合成物。这种新的发现可以分为两种情况:(1)发现了一种新的化合物;(2)在分析的植物物种中发现新的代谢物。第一种情况涉及发现新代谢物的发现,表明发现了一种全新的代谢途径,包括发现新的调节因子和酶基因。第二种情况是对特定组织或植物物种中化合物的新观察。基于eFP浏览器的数据库非常有助于比较代谢物丰度和基因表达数据。目前在比较组织类型和野生种质之间的差异时已经发现了一些无表征代谢物功能的几个例子。理想情况下应进行代谢重组实验。另外的靶向实验,例如分馏,酶测定,水解和某些部分的衍生化测试,将另外有助于阐明新代谢物的准确化学结构。

结论

为简化这些建议的采用,我们提供了两个表格(见附件)。表1包含有关代谢物数据报告的简单问题清单,我们建议在提交未来稿件时填写这些问题。表2提供了对典型LC-MS实验的呈现所包括的补充数据的建议。我们建议使用这些表格将改善代谢物数据的报告。

评  论

本文的研究结果提供了一些关于代谢物分析过程(包括取样,提取和储存方法,代谢物鉴定,大样本数量的处理,以及报告代谢物鉴定方法和代谢物定量确定性水平方面)的建议,这些建议不仅能改善代谢物数据报告的质量,并且可以提升大家对植物组代谢的认知。





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