CircPTK2通过与蛋白vimentin结合调控结直肠癌转移

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东南大学陈瑞教授团队以及中国药科大学杨勇教授团队合作,在结直肠癌发生与转移的病理机制研究方向发表了题为“CircPTK2 (hsa_circ_0005273) as a novel therapeutic target for metastatic colorectal cancer”的研究性论文。该论文应用美国Arraystar Human CircRNA芯片筛选出一个在结直肠癌组织中显著高表达的环状RNA分子circPTK2。临床分析发现,circPTK2的高表达与结直肠癌患者的生存情况有密切关系。细胞和小鼠移植瘤实验均表明circPTK2具有显著的促癌能力,能够促进肿瘤细胞的增殖并增强其转移能力。机制研究发现circPTK2通过与一个经典的癌症转移相关蛋白vimentin结合,调控结直肠癌的转移。该研究成果于2020年1月发表在国际著名学术期刊Molecular Cancer (IF:15.302)。(芯片实验由丨提供技术服务

CircPTK2通过与蛋白vimentin结合调控结直肠癌转移

研究背景 

结直肠癌(CRC)作为世界上发病率排名前三的癌症之一,是一种临床常见的肿瘤类型。在中国,结直肠癌的病死率在过去十年间逐步增加,目前在导致死亡的所有癌症类型中排名前五。尽管对于结直肠癌的早期诊断以及治疗已经取得了较大的进展,但是人们在应对结直肠癌晚期的远端转移问题方面依旧束手无策。因此,对于结直肠癌转移的相关分子机制研究具有非常重要的意义。

环状RNA(circRNA)是一类通过线性RNA分子的3’端和5’端反向拼接共价连接形成的环状RNA分子,可以由外显子、内含子或者同时包含这两种序列的片段组成。与线性分子相比,这种环形的结构可提高环状RNA的稳定性。环状RNA发挥功能主要有四种机制:1、环状RNA可以通过吸附miRNA发挥ceRNA机制。2、环状RNA可以结合特定的蛋白,调控靶蛋白的功能。3、某些环状RNA具有潜在的翻译能力,能够产生具有活性的短肽。4、环状RNA能够结合DNA影响基因的表达。

研究思路

为了研究影响结直肠癌发生与转移的环状RNA,作者选取了六个结直肠癌患者的癌组织样本,通过与癌旁组织样本进行对比,采用Arraystar Human CircRNA芯片筛选了表达差异倍数大于2,P值小于0.05的circRNA。最终找到在结直肠癌组织中表达上调的环状RNA分子circPTK2。随后作者利用免疫组化等实验发现在临床患者结直肠癌组织中能够检测到circPTK2的高表达,并且进一步利用KM曲线等方式分析患者的生存情况,表明circPTK2的高表达与结直肠癌的发生与转移有着非常密切的关系。

为了进一步研究circPTK2的功能,作者首先在细胞模型中过表达/敲低circPTK2。通过克隆形成以及transwell迁移/侵袭等实验发现,在结直肠癌细胞系中,circPTK2能够促进细胞增殖并抑制凋亡,同时还能够增强细胞的迁移以及侵袭能力。随后,作者在小鼠模型中进一步研究了circPTK2的促癌能力,将过表达circPTK2的结直肠癌细胞系细胞或者高表达circPTK2的结直肠癌患者细胞注射到小鼠体内,发现小鼠体内原位瘤以及转移瘤的大小明显增加,而注射低表达circPTK2的细胞则得到相反的表型。因此,细胞和动物实验均表明circPTK2具有显著的促癌能力,能够促进肿瘤细胞的增殖并增强其转移能力。

最后作者研究了circPTK2发挥促癌能力的具体机制。首先利用RNA pull-down的方法,找到了一系列能够与circPTK2结合的蛋白。随后利用质谱鉴定发现一个经典的癌症转移相关蛋白vimentin能够与circPTK2结合。作者接下来通过一系列过表达/敲低实验发现circPTK2促癌的表型能够通过敲低vimentin得到回复,同时vimentin过表达产生的促癌表型则不受circPTK2敲低的影响,证明circPTK2通过vimentin发挥功能。进一步的,作者还发现circPTK2通过与具有特定位点磷酸化的vimentin蛋白结合,影响vimentin在细胞内的含量从而发挥促癌功能。总体而言,circPTK2作为在结直肠癌中高表达的环状RNA,对于结直肠癌的发生与转移具有重要作用。对circPTK2的研究能够增进人们对于结直肠癌的理解,并有助于开发应对晚期结直肠癌的新型治疗手段。

技术路线

CircPTK2通过与蛋白vimentin结合调控结直肠癌转移

结果展示

 CircPTK2通过与蛋白vimentin结合调控结直肠癌转移

图1. Arraystar Human CircRNA芯片筛选结果。A:差异circRNA的聚类图(FC≥2,P<0.05,n=6),在结直肠癌组织中高表达的前30个环状RNA中挑选到circPTK2(hsa_circRNA_0005273);B:CircPTK2由PTK2基因的3个外显子环化组成。

CircPTK2通过与蛋白vimentin结合调控结直肠癌转移

图2. CircPTK2临床样本验证及数据分析。A:免疫组化染色显示circPTK2(红色)在结直肠癌组织与癌旁组织的分布情况,结果表明circPTK2在癌组织中高表达;B:KM曲线分析circPTK2低表达患者组(红线)与circPTK2高表达患者组(黑线)的生存率随时间变化情况,结果显示circPTK2高表达的患者总生存时间更短。

CircPTK2通过与蛋白vimentin结合调控结直肠癌转移

图3. CircPTK2的功能研究。A:克隆形成实验研究circPTK2对于细胞增殖的影响,结果表明敲低circPTK2会减弱细胞增殖的能力;B:Transwell实验研究肿瘤细胞迁移以及侵袭的能力,过表达circPTK2后会导致肿瘤细胞迁移以及侵袭能力增加;C:建立小鼠肿瘤模型研究circPTK2的功能。敲低circPTK2的癌细胞从脾脏转移到小鼠肝脏形成的转移灶更小。

CircPTK2通过与蛋白vimentin结合调控结直肠癌转移

图4. CircPTK2的机制研究。A:RNA pull-down实验显示circPTK2能够与vimentin结合;B:RNA pull-down实验显示circPTK2结合的vimentin不同位点磷酸化水平有所区别;C:circPTK2与vimentin的表达水平呈正相关关系。

研究意义

作者利用Arraystar Human CircRNA芯片在结直肠癌中找到了调控癌细胞生长以及转移的环状RNA分子circPTK2。随后的临床大样本研究证明circPTK2与结直肠癌患者的不良预后显著相关。进一步的功能研究在细胞层面上验证了circPTK2能够调控细胞生长,凋亡以及迁移与侵袭的能力,而在小鼠层面上的研究则表明circPTK2能够促进原位癌的生长与转移。最后作者通过一系列机制实验研究发现circPTK2能够通过结合经典的癌症转移相关蛋白vimentin,影响vimentin的磷酸化与表达水平来发挥相应的促癌功能。总体而言,这项工作思路清晰,数据详实,具有很高的科研价值与应用价值,为结直肠癌的治疗提供了新的思路与方法。

文章出处

CircPTK2 (hsa_circ_0005273) as a novel therapeutic target for metastatic colorectal cancer. Molecular Cancer. 2020

相关服务 
Arraystar circRNA芯片

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