Arraystar circRNA芯片应用| Circ2082通过结合DICER影响miRNA加工成熟进而促进肿瘤生长

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所属分类:文献分享

近期,哈佛大学医学院附属布莱根妇女医院Godlewski教授发表名为“The nuclear DICER–circular RNA complex drives the deregulation of the glioblastoma cell microRNAome”的研究性论文。该论文应用Arraystar Human CircRNA芯片验证了一个环状RNA分子circ2082胶质母细胞瘤中表达异常升高,而circ2082能够通过DICER蛋白影响下游整体的基因表达情况进而促进肿瘤生长该研究成果于202012月发表在国际著名学术期刊Science Advances (IF: 13.116)上。(芯片实验Arraystar提供技术服务

 Arraystar circRNA芯片应用| Circ2082通过结合DICER影响miRNA加工成熟进而促进肿瘤生长

研究背景

胶质母细胞瘤作为一种常见的脑部恶性肿瘤主要由星型胶质细胞癌变产生。由于该肿瘤具有浸润性高等特点,即使进行手术切除以及高度积极的治疗也难以避免肿瘤的复发。有临床数据表明,胶质母细胞瘤患者的生存期中位数仅为1年。因此,对于胶质母细胞瘤发生发展的机理研究对于相关疾病的治疗具有非常重要的价值。

环状RNAcircRNA)是一类将线性RNA分子的3’端和5’端通过反向剪切共价连接形成的环状RNA分子,可以由外显子、内含子或者同时包含这两种序列的片段组成。与线性分子相比,这种环形的结构可提高环状RNA的稳定性。环状RNA发挥功能的机制包括结合特定的蛋白来调控靶蛋白的功能,参与ceRNA调控机制

miRNA是一类长17-25nt的小非编码RNA,主要功能包括与目的RNA结合从而抑制翻译或导致其降解等miRNA的加工成熟主要分为两步,从最初的pri-mRNA剪切形成pre-miRNA,进一步pre-miRNA进行剪切最终形成成熟miRNA。在这一过程中,细胞质里的DICER参与了pre-miRNA的剪切,因而对于miRNA的成熟非常重要

本次研究系统地探讨了环状RNA在胶质母细胞瘤发生发展中的作用提出了环状RNA通过结合蛋白来影响miRNA发挥功能的新机制对于后续相关研究具有重要的借鉴意义

技术路线

Arraystar circRNA芯片应用| Circ2082通过结合DICER影响miRNA加工成熟进而促进肿瘤生长 

 

研究思路

TCGA数据库数据分析

为了研究影响胶质母细胞瘤发生发展的机制。作者采用TCGA数据库数据进行分析挑选了490例胶质母细胞瘤患者数据以及11例正常人数据进行比较发现在胶质母细胞瘤患者中整体miRNA的表达量偏低。此外,PCA分析发现,对比胶质母细胞瘤患者正常人体内的miRNA表达谱两者间具有明显差异。因此作者考虑是否胶质母细胞瘤患者癌细胞内miRNA加工成熟机制遭到破坏。

circ2082在细胞核内结合DICER

miRNA加工成熟包括了pri-miRNA在细胞核内剪切产生pre-miRNA,pre-miRNA出核之后在细胞质中的DICER作用下被剪切产生成熟的miRNA作者通过核质分离后western blot检测等实验发现在间充质型胶质母细胞瘤干细胞以及前神经元型胶质母细胞瘤干细胞中DICER均存在显著的细胞核定位的现象,从而阻止其在细胞质中促进miRNA的成熟。随后,作者利用胶质母细胞瘤干细胞的细胞核与细胞质组分进行了IP等实验,发现DICER在细胞核中与RBM3结合更重要的是通过使用DICER抗体在胶质母细胞瘤干细胞的细胞质组分中进行RIP实验RNA产物进行测序作者发现了能够与DICER结合的环状RNA分子,circ2082。

Arraystar Human CircRNA芯片验证

    为了进一步研究胶质母细胞瘤干细胞中环状RNA分子的分布情况作者选取非恶性神经祖细胞(n=3),间充质型胶质母细胞瘤干细胞(n=4)以及前神经元型胶质母细胞瘤干细胞(n=4)进行Arraystar Human CircRNA芯片筛选以及q-PCR验证。筛选结果表明circ2082在胶质母细胞瘤干细胞内显著上调且在整体环状RNA表达谱内排名前五说明circ2082对于胶质母细胞瘤的发生发展具有非常重要的影响

功能研究

为了证明circ2082具有促癌效果,首先作者在细胞层面上进行干细胞成球等实验结果表明敲低circ2082会导致胶质母细胞瘤干细胞的增殖减弱个体层面上通过尾静脉注射等实验作者发现在注射的胶质母细胞瘤干细胞中敲低circ2082能够显著延长被注射小鼠的生存期。最后,作者利用TCGA数据库中相关数据分析通过KM曲线发现circ2082的下降能够提高胶质母细胞瘤患者的生存时间

机制研究

接下来,作者研究了circ2082发挥促癌功能的具体机制。首先,免疫荧光等实验表明在胶质母细胞瘤干细胞中敲低circ2082能够导致DICER重新分布在细胞质中,从而促进大部分miRNA(包括重要的抑癌miRNA,如miR-128、miR-124、miR-1的表达上调。除此之外,重要的促癌miRNA例如miR-21等则出现下调,表明circ2082除了能够抑制整体miRNA的表达外也可能存在其他促进肿瘤发生发展的机制有待深入研究。随后,作者采用Agilent Whole Human Genome芯片检测了mRNA的表达变化情况,发现在基因层面上,circ2082发挥促癌功能受不同细胞亚型的影响很大


 
结果展示

Arraystar circRNA芯片应用| Circ2082通过结合DICER影响miRNA加工成熟进而促进肿瘤生长

1. 胶质母细胞瘤患者miRNA表达整体偏低

A:胶质母细胞瘤患者(n=490正常人(n=11成熟miRNA表达谱热图。细胞亚型:红色,间充质型蓝色,典型;绿色,前神经元型。535miRNA表达数据来源TCGA数据库

BPCA分析能够区分胶质母细胞瘤患者成熟miRNA组(红点n=490)与正常人成熟miRNA(蓝点n=10)。

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2. Circ2082细胞中结合DICER

AWestern blot检测DICER在细胞质(C和细胞核N的分布。NPC非恶性神经祖细胞M GSC间充质型胶质母细胞瘤干细胞P GSC前神经元型胶质母细胞瘤干细胞

B:在胶质母细胞瘤干细胞细胞核组分中分别IgG抗体以及DICER抗体进行RIP实验随后q-PCR检测circ2082的含量。

C:使用同向引物与反向引物在cDNA或者基因组DNAPCR验证circ2082的环状特征

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3. Arraystar Human CircRNA芯片验证

A:差异环状RNA表达谱聚类图。青色:非恶性神经祖细胞n=3);红色:间充质型胶质母细胞瘤干细胞n=4);绿色:前神经元型胶质母细胞瘤干细胞n=4)。

B:胶质母细胞瘤干细胞内差异环状RNA火山图。虚线为筛选阈值,标识出的环状RNA差异上调前五的环状RNA

CQ-PCR验证胶质母细胞瘤circ2082存在表达上调的现象。

  

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4. Circ2082具有促癌效果

A:细胞成球实验表明敲低circ2082能够抑制胶质母细胞瘤细胞的生长能力

B:生存分析表明,尾静脉注射敲低circ2082胶质母细胞瘤细胞小鼠具有更长的生存期。

C:使用TCGA数据库内的临床数据进行KM分析表明,circc2082表达较低的患者具有更高的生存期。

  

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5. Circ2082影响DICER定位与相关基因表达

A:免疫荧光实验表明,在胶质母细胞瘤干细胞内敲低circ2082会导致DICER出核。

BmiRNA表达谱的聚类图显示,在间充质型胶质母细胞瘤干细胞M GSC与前神经胶质母细胞瘤干细胞P GSC内敲低circ2082会导致整体miRNA表达上升,且不同细胞亚型差异不大。

Cq-PCR分析不同亚型肿瘤干细胞敲低circ2082后相应miRNA的变化情况。

DAgilent Whole Human Genome芯片分析敲低circ2082对肿瘤干细胞整体基因表达的影响

研究总结

作者首先通过TCGA数据库数据分析发现胶质母细胞瘤患者体内miRNA表达整体偏低据此将研究目标锁定在对miRNA加工成熟具有重要功能的蛋白DICER通过前期核质分离WB检测以及免疫荧光等实验作者发现在肿瘤细胞中DICER具有异常的细胞核定位据此通过RIP实验发现DICER在细胞核中结合的环状RNA分子circ2082进一步作者利用Arraystar Human CircRNA芯片对胶质母细胞瘤干细胞中的差异环状RNA进行筛选结果表明circ2082在整体的环状RNA表达谱上属于上调前五的RNA分子接下来在功能研究部分作者对circ2082进行敲低发现其能够影响肿瘤干细胞的成球能力。此外,个体层面上的研究发现circ2082能够影响小鼠的生存期以及临床患者的生存期说明circ2082具有促癌的功能机制上看,circ2082能够影响DICER的细胞内定位,从而影响细胞整体的miRNA表达。同时,circ2082的敲低除了能够解除抑癌miRNA的表达抑制之外还能够抑制促癌miRNA的表达最后,作者发现,基因层面上circ2082发挥促癌功能受不同细胞亚型的影响很大。总体而言,作者的研究思路清晰,数据详实,为胶质母细胞瘤的治疗提供了新的思路与方法。

文章链接

https://advances.sciencemag.org/content/6/51/eabc0221

丨可提供的相关技术服务

CircRNA 表达研究技术平台:

 CircRNA表达谱检测——Arraystar circRNA芯片:

针对CircRNA反向剪接位点设计特异性探针,准确检测circRNA,比测序更适合于circRNA表达谱分析。助力客户发表SCI文章超过350篇;

 circRNA qRT-PCR:

技术成熟,circRNA反向剪接位点设计引物,特异性检测目标circRNA

 circRNA与蛋白互作(circRNA ChIRP-MS)

CircRNA作为蛋白海绵或者蛋白结合的骨架,影响蛋白功能 circRNA ChIRP-MS通过用biotin标记的RNA anti-sense与已交联的样本进行杂交,并通过固定化avidinbiotin进行Pull-Down,得到RNA结合蛋白(RBP)并通过质谱鉴定目标circRNA结合的蛋白。

miRNA研究平台

 miRNA seq \ Agilent miRNA芯片

其他circRNA研究技术平台:

 circRNA m6A检测——Arraystar circRNA表观转录组芯片:

检测发生m6A修饰的circRNA;定量修饰百分比及修饰变化;total RNA要求量低至3ug

 circRNA m6A 甲基化PCR检测:

1)验证或者检测某个m6A 修饰的circRNAm6A抗体富集发生m6A修饰的circRNA + circRNA反向剪接位点设计引物保证m6A-circRNA的精确检测

2) 确定含有潜在m6ACA位点的circRNA是否真实发生m6A修饰:RNase R去线性RNA+ MazF酶处理 + m6ACA位点PCR检测 。

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