lncRNA JPX通过ceRNA机制调控肺癌的发生发展和转移

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宁波大学医学院龚朝辉教授团队主要从事肿瘤分子生物学研究今年该研究团队应用Arraystar lncRNA芯片筛选发现了一个在肺癌中异常上调的lncRNA——JPXlncRNA分子通过与miR-33a-5p结合而充当Twist1ceRNA,影响肿瘤的大小、TNM分期和肺癌的转移。进一步深入研究表明,JPX是通过调节miR-33a-5p/Twist1,参与了Wnt/β-catenin信号的激活,进而促进了EMT过程,最终影响了肺癌的发生发展。该研究提示JPX/miR-33a-5p/Twist1轴可能具有治疗肺癌的潜力,具有作为药物作用靶点的潜力。该研究成果发表在Molecular Cancer上(IF:15.302)上。(芯片实验由丨提供技术服务

lncRNA JPX通过ceRNA机制调控肺癌的发生发展和转移

研究背景

肺癌是最恶性的癌症之一,其5年生存率根据阶段和地区差异在4%至17%之间变化。尽管近年来在肺癌的诊断和治疗方面已经取得了许多进展,但是晚期肺癌的转移仍然是导致高死亡率的主要原因。因此,需要阐明新的致癌途径,精确靶向治疗肺癌。

长非编码RNAlncRNA)是一类长于200个核苷酸的RNA分子,对癌症的发生、发展有重要影响。异常表达的lncRNA与各种类型的癌症的发生和发展有关,在lncRNA-miRNA-mRNA调控网络中,lncRNA充当特定mRNA的竞争性内源RNAceRNA),调节靶基因,影响基因表达。然而,肺癌中异常表达的lncRNA的功能和机制尚不清楚。

Twist1是一种重要的转录因子,可介导上皮-间质转化(EMT)进展和肿瘤转移。此外,Wnt/β-catenin信号传导是EMT和癌症转移的关键驱动因素。作者以前的研究表明,miR-33a-5p负调控Twist1,从而抑制了非小细胞肺癌(NSCLC)的侵袭和转移,miR-33a-5p可以作为早期肺癌诊断的潜在生物标志物。

因此,作者考虑lncRNA是否可以与miR-33a-5pTwist1形成ceRNA网络以参与肺癌的EMTs和恶性发展过程。

技术路线

lncRNA JPX通过ceRNA机制调控肺癌的发生发展和转移 

研究思路

LncRNA高通量筛选PCR验证

为了筛选到影响肺癌患者疾病进程的lncRNA分子,作者选择了4对人类肺癌组织和癌旁组织样本,应用Arraystar Human LncRNA芯片筛选差异表达的lncRNA,共筛选出1551个差异表达的lncRNA,其中817lncRNA表达上调,734lncRNA表达下调(图1A)。

接下来,使用miRNA-lncRNA相互作用数据库Starbase预测可能与miR-33a-5p相互作用的lncRNA。结果显示61lncRNA存在miR-33a-5p结合位点。这61lncRNA1551个差异表达的lncRNA取交集后发现,lncRNA JPX既在肿瘤样本中表达量出现异常升高,又通过互补碱基对的七个连续配对与miR-33a-5p相互作用(图1B)。

RT-qPCR检测116对肺癌组织和癌旁组织中的JPX表达量,结果显示肺癌组织中的JPX表达明显高于癌旁组织(图1C)。回归分析表明,116例肺癌患者中,JPX的表达与肿瘤大小和TNM分期密切相关(图1D)。

lncRNA JPX通过ceRNA机制调控肺癌的发生发展和转移

图1.  Arraystar Human lncRNA芯片筛选结果及验证

A. 四对肺癌组织和癌旁组织的差异表达的lncRNA

B. 红色表示肺癌中表达量上调的lncRNA,绿色表示表达量下调的lncRNA。蓝色表示StarBase数据库预测可能和miR-33a-5p有结合的lncRNA数据集。结果的重叠处为lncRNA JPX

C. RT-qPCR检测到116个配对的肺癌相对于癌旁组织JPX相对表达量上调。

D. RT-qPCR分析四种肺癌细胞系(SPC-A-1LTEP-a-2A549NCI-H1299)相对正常肺上皮细胞系(BEAS-2B)中JPX相对表达量上调


功能研究

为了研究JPX的生物学功能,使用重组质粒提高JPX在肺癌细胞系中表达,使用siRNA特异性敲低JPX在肺癌细胞系中表达。结果表明,JPX体外过表达促进了肺癌细胞的生长和增殖(图2A2B2C),而JPX敲低则抑制了肺癌细胞的生长和增殖。另一方面,利用伤口愈合实验和Transwell分析实验,检测JPX对肺癌细胞迁移和侵袭的影响。结果表明,JPX小鼠体内过表达可以增强肺癌细胞的迁移和侵袭(图2D),而JPX敲低则抑制了肺癌细胞的迁移和侵袭。

lncRNA JPX通过ceRNA机制调控肺癌的发生发展和转移

 图2.  JPX体外过表达促进肺癌细胞的生长和增殖,增强肺癌细胞的迁移和侵袭能力

A. 进行CCK-8检测,分析JPX过表达后肺癌细胞的生存力增强。

B. 集落形成分析法检测JPX过表达后肺癌细胞的增殖能力增强。

C. 裸鼠种植稳定表达JPXNCI-H1299细胞后,肿瘤生长能力增强。

D. 通过Transwell检测到JPX过表达后细胞的侵袭能力增强。


机制研究

为了揭示JPXmiR-33a-5p协同调控肺癌进程的生物学机制,首先利用核质分离实验(Nuclear-cytoplasmic fractionation)得到JPX主要定位在肝癌细胞的细胞质中,进一步利用双荧光素酶报告基因实验(dual-luciferase reporters assay)、RT-qPCRPearson相关分析,表明JPX发挥ceRNA调控机制,在肺癌细胞中发挥mir-33a-5p海绵的功能,通过靶向结合miR-33a-5p间接调控靶基因(图3A3B)。体外细胞水平回补JPX的实验结果表明JPX通过调控miR-33a-5p,促进肺癌细胞增殖,迁移和侵袭的能力(图3C3D)。

lncRNA JPX通过ceRNA机制调控肺癌的发生发展和转移 

3.  JPX发挥ceRNA调控机制,在肺癌细胞中作为海绵,靶向结合miR-33a-5p

A. miR-33a-5p共转染的细胞中,突变的(MUTJPX报告质粒的相对荧光素酶活性明显高于野生型(WT)质粒。

B. RT-qPCR检测到敲除JPXmiR-33a-5p相对表达量上调。

C. 通过伤口愈合实验检测JPX过表达对miR-33a-5p介导的细胞迁移抑制的回补效应。

D. 通过Transwell检测到JPX过表达对miR-33a-5p介导的细胞侵袭抑制的回补效应。

  

由于已知研究表明miR-33a-5p负调控其靶基因Twist1,作者进一步研究JPXTwist1在肺癌中的关系。对95对肺癌组织和癌旁组织样本检测的结果表明,Twist1在肺癌组织中高表达。Pearson相关分析表明,在肺癌患者中,JPX表达与Twist1正相关(图4A)。在肿瘤模型小鼠中,RT-qPCR显示,JPX表达在肿瘤组织中显著上调。JPX过表达诱导肿瘤组织中,Twist1RNA和蛋白质层面(图4B)表达均增加。总体而言,数据表明JPXTwist1在肺癌进程中协同上调。

另一方面,已知Wnt/β-catenin信号通路是EMT的驱动器,通过蛋白免疫印迹研究表明,JPX通过调节miR-33a-5p/Twist1,激活Wnt/β-catenin信号传导,介导的EMT进程(图4C4D)。

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 图4.  JPX/miR-33a-5p/Twist1通过激活Wnt/β-catenin途径促进肺癌细胞的EMT进展

A. RT-qPCR检测Twist1JPX表达量高的临床样本中的相对表达量上调。

B. 蛋白免疫印迹检测到过表达JPXSPC-A-1NCI-H1299细胞系中,EcadherinN-cadherinVimentinTwist1GSK-3ββ-catenin的表达量。

C. 蛋白免疫印迹检测si-CTNNB1+pcDNA3.1-JPX转染后SPC-A-1细胞中β-cateninE-cadherinN-cadherin的表达量。

D. 蛋白免疫印迹检测si-Twist1+pcDNA3.1-JPX转染后的SPC-A-1细胞中GSK-3ββ-catenin的表达量。

总结全文,研究结果表明,JPX/miRNA-33a-5p/Twist1轴可作为新的ceRNA调控网络,通过激活Wnt/β-catenin信号通路参与EMT过程,从而加速了肺癌的恶性进程。这些研究结果提示,JPX可以作为潜在的治疗靶标和精准诊断和治疗肺癌的新型生物标志物。

文章出处

https://molecular-cancer.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12943-020-1133-9

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