磷酸化检测揭示植物免疫新机制

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青莲客户又喜提高分文章啦! 2020年10月5日,中科院微生物研究所刘俊课题组在Molecular Plant杂志(IF:12.084)上在线发表了题为“A plant lectin receptor-like kinase phosphorylates the bacterial effector AvrPtoB to dampen its virulence in Arabidopsis”的研究论文。研究报道了拟南芥凝集素受体激酶LecRK-IX.2可以与丁香假单胞菌( Pseudomonas syringae )效应蛋白AvrPtoB相互作用并使其磷酸化,来削弱该效应蛋白的毒性,从而增强植物免疫。很荣幸,技术支持了文章中磷酸化肽段的LC-MS/MS检测工作。下面小编来给大家分享一下该文章。

磷酸化检测揭示植物免疫新机制

研究背景

随着植物不断暴露于各种病原体中,在进化过程中获得了一套有效的先天免疫系统以应对病原体的侵染。细胞膜上的模式识别受体(PRRs)可以识别病原体保守的特征物质,如细菌的鞭毛蛋白、伸长因子和真菌的几丁质等,从而激活植物免疫。多种病原体可以分泌效应蛋白进入植物体内,干扰PRRs对病原体的识别或其介导的免疫激活通路,促进病菌致病性。效应蛋白通过多种方式干扰PRRs的功能,如阻止其磷酸化下游信号通路组分,或直接降解PRRs等。因此,病原体的效应蛋白的功能目前认为是主要干扰寄主抗性的。

样本选择

拟南芥Lecrk-IX.2和△avrPtoB突变菌株


研究结果

LecRK-IX.2可在S335位点磷酸化AvrPtoB

研究人员采用LC-MS/MS技术对LecRK-IX.2磷酸化的AvrPtoB进行了分析。MS结果显示,位于40个氨基酸的肽段中S335位点的磷酸化覆盖了AvrPtoB磷酸化的 96%(图1B),这表明AvrPtoB S335可能是LecRK-IX.2磷酸化的残基。为了证实这一发现,研究人员使用AvrPtoBS335A作为LecRK-IX.2的底物进行了体外激酶测定(S335被取代为丙氨酸)。因为先前的研究显示AvrPtoB T450被Pto和Fen磷酸化,所以该研究使用AvrPtoB T450A作为对照。研究发现,LecRK-IX.2可有效地磷酸化AvrPtoB,但无法磷酸化AvrPtoBS335A(图1C)。值得注意的是,LecRK-IX.2仍可以将AvrPtoBT450A磷酸化。这些结果表明,LecRK-IX.2介导的AvrPtoB在S335位点的磷酸化是特异性的,并且S335是一个被宿主蛋白磷酸化的新位点。

磷酸化检测揭示植物免疫新机制

图1. LecRK-IX.2在S335位点磷酸化AvrPtoB


S335位点的磷酸化可抑制AvrPtoB的毒性

生化数据表明LecRK-IX.2使AvrPtoB磷酸化可能破坏其毒性。为了证实这一推测,研究人员首先检查了AvrPtoB及其突变体的细菌分泌以及研究拟南芥中这些蛋白质的亚细胞定位。结果显示在S335处AvrPtoB的磷酸化不干扰细菌分泌或其在植物中的亚细胞定位。进一步分析表明AvrPtoB的磷酸化削弱了其对拟南芥中PTI的抑制作用。最后研究人员评估了AvrPtoB磷酸化对植物细菌生长的影响。生长曲线分析显示,Pst(∆avrPtoB)和Pst(avrPtoBS335D)表现出相似的毒性。与PTI响应一致,Pst(avrPtoBS335D)感染产生的细菌滴度比Pst、Pst(avrPtoBWT)或Pst(avrPtoBS335A)感染产生的细菌滴度低得多。这些结果表明,在S335位点AvrPtoB的磷酸化减弱了其毒性。

磷酸化检测揭示植物免疫新机制

图2. S335位点AvrPtoB的磷酸化会削弱其毒性


flg22可增强LecRK-IX.2对AvrPtoB的磷酸化

该团队先前报道了flg22可以在数小时内诱导LecRK-IX.2表达,而LecRKIX.2/IX.1参与flg22诱导的PTI。因此,假设flg22可以增强AvrPtoB磷酸化。为了证实该结果,研究人员首先检查了flg22处理后AvrPtoB S335位点的磷酸化。不出所料,AvrPtoB S335位点在Col-0中被磷酸化,而flg22处理增加了磷酸化水平;但是,flg22诱导的AvrPtoB S335位点磷酸化很大程度上取决于LecRK-IX.2/IX.1。接下来,检查了LecRK-IX.2对flg22处理的早期反应,发现flg22可能在几分钟内就上调了LecRK-IX.2的表达,表明LecRK-IX.2是PTI中的早期反应基因。

磷酸化检测揭示植物免疫新机制

图3. flg22通过LecRK-IX.2促进S335位点的AvrPtoB磷酸化

结论

总之,该研究揭示了一种新的机制,通过该机制,植物LecRK蛋白LecRK-IX.2在S335位点处磷酸化了细菌效应因子AvrPtoB,从而潜在地降低了其毒性。该策略可能被植物RLKs广泛采用,在PTI响应过程中病原体效应因子会靶向该植物。这项工作实质上提高了我们对PTI激活的认识。此外该研究还注意到,存在去除植物中AvrPtoB S335位点磷酸化的机制。这可能是为什么植物中只有一定量的AvrPtoB被磷酸化的原因。结果表明,在病原体感染期间,AvrPtoB毒性仅部分降低。

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植物凝集素受体样激酶磷酸化细菌效应子AvrPtoB以抑制其在拟南芥中的毒性

期刊名称:Molecular Plant

IF:12.084

样本选择:拟南芥Lecrk-IX.2和△avrPtoB突变菌株

技术策略:磷酸化位点鉴定(LC-MS/MS)

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