酵母双杂交的那些事

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所属分类:基因组学

     
 酵母双杂交由Fields和Song在1989年提出.
他的产生是基于对真核细胞转录因子特别是酵母转录因子GAL4性质的研究。酵母双杂交就是基因转录所需的转录因子的两个结构域在两个互作蛋白的吸引下位置靠近,诱导了基因的表达。
     
 酵母双杂交系统的最主要的应用是快速、直接分析已知蛋白之间的相互作用,及分离新的与已知蛋白作用的配体及其编码基因。酵母双杂交系统检测蛋白之间的相互作用具有以下优点:
作用信号是在融合基因表达后, 在细胞内重建转录因子的作用而给出的, 省去了纯化蛋白质的繁琐步骤。
检测在活细胞内进行, 可以在一定程度上代表细胞内的真实情况。
检测的结果可以是基因表达产物的积累效应, 因而可检测存在于蛋白质之间的微弱的或暂时的相互作用。
酵母双杂交系统可采用不同组织、器官、细胞类型和分化时期材料构建cDNA文库,
能分析细胞浆、细胞核及膜结合蛋白等多种不同亚细胞部位及功能的蛋白。
 
     
 酵母双杂交系统是分析蛋白-蛋白间相互作用的有效和快速的方法,但仍存在一些问题有待解决。
     
 酵母双杂交系统应用中常遇到的问题之一是假阳性较多。所谓假阳性就是:在待研究的两个蛋白间没有发生相互作用的情况下,报告基因被激活。主要原因是由于BD融合诱饵蛋白有单独激活作用,或者这种融合蛋白的激活作用被外来蛋白激活。另外AD融合靶蛋白如果有DNA的特异性结合,则也可单独激活报告基因的表达。因此,为排除假阳性就需要作严格的对照试验。应对诱饵和靶蛋白分别作单独激活报告基因的鉴定。目前酵母双杂系统都采用了多个报告基因,且每个报告基因的上游调控区各不相同,这可减少大量的假阳性。另外,报告基因通常整合到染色体上,可以使基因表达水平稳定,消除了由于质粒拷贝数变化引起基因表达水平波动而造成的假阳性。
     
 在酵母双杂交的应用中有时也会遇到假阴性现象。所谓假阴性,即两个蛋白本应发生相互作用,但报告基因不表达或表达程度甚低以至于检测不出来。造成假阴性的原因主要有两方面:一是融合蛋白的表达对细胞有毒性。这时应该选择敏感性低的菌株或拷贝数低的载体。二是蛋白间的相互作用较弱,应选择高敏感的菌株及多拷贝载体。目前假阴性现象虽不是实验中的主要问题,但也应予以重视。
 
     
 转化效率是酵母双杂交文库筛选时成败的关键之一,特别是对低丰度cDNA库进行筛选时,必须提高转化效率。转化时可采用共转化或依次转化,相比之下共转化省时省力。更重要的是如果单独转化会发生融合表达蛋白对酵母细胞的毒性时,共转化则可以减弱或消除这种毒性。一种更有效的方法是将诱饵蛋白载体与靶蛋白载体分别转入不同接合型的单倍体酵母中,通过两种接合型单倍体细胞的杂交将诱饵蛋白与靶蛋白带入同一个二倍体细胞。
近年来,还有许多研究者对双杂交系统进行了改进和发展。例如采用假阳性显示分析法和双筛选系统以减少"假阳性"的发生;发展哺乳动物双杂交系统更好地研究蛋白间的相互作用。其中双筛选系统用二种不同的报告基因(常用lacZ和HIS3)有以下优势:用不同的启动子表达位于酵母二个染色体上的报告基因,可明显减少假阳性。通过营养型筛选增强了筛选能力,尤其适用于对较大的库容量而被选蛋白较少情况下的筛选。
     
 酵母双杂交系统是在真核模式生物酵母中进行的,研究活细胞内蛋白质相互作用,对蛋白质之间微弱的、瞬间作用也能够通过报告基因的表达产物敏感地检测得到。大量的研究文献表明,酵母双杂交技术在发现新的蛋白质和蛋白质的新功能、研究抗原和抗体相互作用、筛选药物作用位点及药物对蛋白互作影响、建立基因组蛋白连锁图等方面应用广泛。随着对酵母双杂交技术的研究深入和不断优化,酵母双杂交技术与其它技术结合,将更有利于对实验结果作出更为完整和准确的判断。

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